Ο ρόλος της τρισδιάστατης αρχιτεκτονικής της χρωματίνης στο μηχανισμό ενεργοποίησης των ηπατικών γονιδίων κατά την ανάπτυξη

Abstract

Activation of gene expression during development relies on pioneer transcription factors that decondense chromatin and allow the recruitment of additional regulators. Subsequently, non-pioneer transcription factors bind to these regions and remain associated for an extended period before gene activation. During this period, chromatin structure is extensively remodeled, leading to open, transcriptionally competent configurations. However, the actual event that determines the precise timing of activation remains unclear. Growing evidence suggests that three-dimensional genome architecture provides an important regulatory layer. This dissertation focuses on the contribution of spatial genome organization and long-range enhancer–promoter interactions in the activation of hepatic genes during development. To this end, Hi-C and Promoter Capture Hi-C were performed at successive developmental stages, complemented by ChIP-seq, ATAC-seq, and RNA-seq. The results provide an integrated view of the chromatin landscape, three-dimensional genome configurations, and their relationship to transcriptional activation. Our analysis shows that the overall genome architecture is established early in development, with relatively few compartment switches, but significant reorganization of TADs and loop domains at subsequent stages. In developmentally regulated genes, activation is marked by the formation of new promoter–enhancer contacts in the mature liver, highlighting architectural loops as a key mechanism of transcriptional activation. The cohesin complex contributes to this process in two ways: through loop extrusion, bringing distant regulatory elements into proximity, and through promoter tethering of RNA Polymerase II at transcription start sites. The importance of local organization is further supported by knockout models, where the absence of C/EBPα or HNF4α leads to severe disruption of enhancer–promoter networks. Although these factors do not function as the primary trigger of activation, they are essential for the assembly and maintenance of the correct three-dimensional framework.

Η ενεργοποίηση της γονιδιακής έκφρασης κατά την ανάπτυξη βασίζεται σε πρωτοπόρους μεταγραφικούς παράγοντες που αποσυσπειρώνουν τη χρωματίνη και επιτρέπουν τη δέσμευση πρόσθετων ρυθμιστών. Στη συνέχεια, μη πρωτοπόροι μεταγραφικοί παράγοντες προσδένονται σε αυτές τις περιοχές και παραμένουν εκεί για μεγάλο χρονικό διάστημα πριν από την ενεργοποίηση των γονιδίων. Κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου, η δομή της χρωματίνης μεταβάλλεται εκτενώς, οδηγώντας σε ανοιχτές, μεταγραφικά κατάλληλες διατάξεις. Ωστόσο, ο μοριακός μηχανισμός που καθορίζει τον χρόνο ενεργοποίησης παραμένει ασαφής. Αυξανόμενες ενδείξεις υποδηλώνουν ότι η τρισδιάστατη αρχιτεκτονική του γονιδιώματος αποτελεί σημαντικό επίπεδο ρύθμισης. Η παρούσα διατριβή εστιάζει στη συμβολή της χωρικής οργάνωσης και των μακρινών αλληλεπιδράσεων ενισχυτών–υποκινητών στην ενεργοποίηση των ηπατικών γονιδίων κατά την ανάπτυξη. Για τον σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκαν Hi-C και Promoter Capture Hi-C πειράματα σε διαδοχικά αναπτυξιακά στάδια, ενώ τα δεδομένα εμπλουτίστηκαν με ChIP-seq, ATAC-seq και RNA-seq. Τα αποτελέσματα προσφέρουν μια ολοκληρωμένη εικόνα του χρωματινικού τοπίου, των τρισδιάστατων δομών του γονιδιώματος και της σχέσης τους με τη μεταγραφική ενεργοποίηση. Η ανάλυση έδειξε ότι η συνολική αρχιτεκτονική του γονιδιώματος εγκαθίσταται νωρίς κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, με περιορισμένες μεταστροφές διαμερισμάτων, αλλά σημαντική αναδιοργάνωση των TADs και των βρόχων στα επόμενα στάδια. Στα αναπτυξιακά ρυθμιζόμενα γονίδια, η ενεργοποίηση συνοδεύεται από την εμφάνιση νέων επαφών υποκινητή–ενισχυτή στο ώριμο ήπαρ, στοιχείο που δείχνει ότι οι αρχιτεκτονικοί βρόχοι αποτελούν κρίσιμο μηχανισμό για τη μετάβαση σε μεταγραφική δραστηριότητα. Το σύμπλοκο της κοχεσίνης συμβάλλει σε αυτή τη διαδικασία με δύο τρόπους: μέσω εξώθησης βρόχων (Loop extrusion) φέρνει σε επαφή απομακρυσμένους ρυθμιστικούς τόπους και μέσω αγκύρωσης στον υποκινητή (Promoter tethering) της RNA Πολυμεράσης II στο σημείο έναρξης μεταγραφής. Η σημασία της τοπικής οργάνωσης επιβεβαιώνεται και από τα μοντέλα knockout (KO), όπου η απουσία των C/EBPα και HNF4α οδηγεί σε εκτεταμένες διαταραχές στα δίκτυα ενισχυτών–υποκινητών. Αν και οι παράγοντες αυτοί δεν λειτουργούν ως το κύριο ερέθισμα για την ενεργοποίηση, είναι απαραίτητοι για την συγκρότηση και τη διατήρηση του σωστού τρισδιάστατου πλαισίου.