Ο ρόλος της κυτταρικής γήρανσης στην ηπατική στεάτωση σχετιζόμενη με μεταβολική δυσλειτουργία

Abstract

Background: The present study aimed to highlight the role of cellular senescence in metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD) pathogenesis and the impact of aerobic exercise and dietary restriction on liver senescence when applied alone or combined. Senescence, which is thought as an established hallmark of MASLD, represents a state of cell cycle arrest and simultaneous resistance to apoptosis. Methods: Two comprehensive preclinical studies were performed. Study 1: C57BL/6 8-month-old mice were subjected to two different diet protocols, which differed in the presence of obesity. For the long-term protocol with obesity, mice were administered a high-fat diet (HFD) for 18 weeks, while the control group received a normal diet (ND). For the short-term non-obese NAFLD model, mice were fed a high-fat, choline-deficient, low-methionine diet (HFD-CD) for 2 weeks, while the control group was fed with a standard control diet (CTRL). Followingly, a histological study of the disease, analysis of expression in the liver tissue of genes related to steatosis and cellular senescence, as well as an immunohistochemical study of cellular senescence, were performed. In addition, a study of markers related to "reproductive" aging (telomere length, total DNA methylation) and oxidative stress (MDA levels in liver tissue) was conducted. Study 2: C57BL/6 mice were subjected to a normal diet (ND) for 20 weeks or a high-fat diet (HFD) supplemented with 5% High-fructose Corn Syrup (HFCS) for 12 weeks, followed by eight weeks of aerobic exercise (EX), or dietary restriction (DR), or the combination of both interventions (DREX) or continuation of an HFD-HFCS diet without any intervention. At the end of the 20-week experiment, the presence of senescence in liver tissue was compared between the mice groups. In particular, senescence biomarkers were evaluated through hepatic mRNA expression levels, while GL13, p21WAF1/CIP1, and p16INK4A immunohistochemical stainings were conducted. Finally, possible correlations between the aforementioned senescence markers and hepatic steatosis and fibrosis were investigated. Results: Study 1: In both models, liver fat accumulation and increased hepatic mRNA expression of steatosis-related genes were accompanied by hepatic senescence, indicated by the increased expression of senescence-associated genes and the presence of a robust hybrid histo-/immunochemical senescence-specific staining in the liver. Importantly, telomere length and global DNA methylation did not differ between the steatotic and the control livers, while malondialdehyde, a marker of oxidative stress, was upregulated in the mouse NAFLD livers. Study 2: Diet alone or combined with exercise led to a statistically significant reduction in body weight and MASLD-related liver steatosis and fibrosis; the impact of DR and DREX was proven superior to the relevant amelioration induced by the implementation of aerobic exercise. Additionally, the aforementioned interventions led to a significant decrease of the cyclin-dependent kinase p21WAF1/CIP1mRNA expression in the liver. Finally, the immunohistochemical staining for GL13 and p21WAF1/CIP1 confirmed relevant changes of p21WAF1/CIP1 at the hepatic sections, while also revealed a p16INK4A elevation in HFD livers, which was reversed only upon DR/DREX.Conclusion: Liver senescence is involved in MASLD pathogenesis regardless of advanced age and obesity. The phenomenon is responsive both to exercise and dietary restriction, but its amelioration in the context of MASLD is more robust upon DR-inclusive interventions.

Σκοπός: Η παρούσα μελέτη στοχεύει στην αποκρυπτογράφηση του ρόλου της κυτταρικής γήρανσης στην παθογένεια της ηπατικής στεάτωσης που σχετίζεται με τη μεταβολική δυσλειτουργία (MASLD) και εν συνεχεία της επίδρασης της αερόβιας άσκησης και του διαιτητικού περιορισμού, όταν εφαρμόζονται μεμονωμένα ή σε συνδυασμό, στη γήρανση του ήπατος. Η κυτταρική γήρανση χαρακτηρίζεται από διακοπή του κυτταρικού κύκλου και ταυτόχρονη αντίσταση στην απόπτωση και θεωρείται ορόσημο για την MASLD. Μέθοδοι: Δύο ξεχωριστές προκλινικές μελέτες διεξήχθησαν για τη διερεύνηση των ανωτέρω. Μελέτη 1: Μύες C57BL/6 ηλικίας 8 εβδομάδων υποβλήθηκαν σε δύο διαφορετικά μοντέλα διατροφής. Για το μακροπρόθεσμο μοντέλο νόσου με συνοδό παχυσαρκία, οι μύες έλαβαν δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά (HFD) για 18 εβδομάδες ενώ η ομάδα ελέγχου έλαβε κανονική δίαιτα (ND). Για το βραχυπρόθεσμο μοντέλο νόσου χωρίς στο τέλος να προκύψουν παχύσαρκα πειραματόζωα, οι μύες έλαβαν δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά, έλλειψη χολίνης, χαμηλής περιεκτικότητας σε μεθειονίνη (HFD-CD), ενώ η ομάδα ελέγχου έλαβε μια τυπική δίαιτα (CTRL) για 2 εβδομάδες. Ακολούθησε ιστολογική μελέτη της νόσου, μελέτη της γονιδιακής έκφρασης στον ηπατικό ιστό γονιδίων σχετιζόμενων με τη στεάτωση και με την κυτταρική γήρανση, καθώς και ανοσοϊστοχημική μελέτη της κυτταρικής γήρανσης με χρώση GL13. Επιπλέον, έγινε μελέτη δεικτών που σχετίζονται με «αναπαραγωγική» γήρανση (μήκος τελομερών, ολική μεθυλίωση DNA) και με οξειδωτικό στρες (επίπεδα μαλονικής ή μηλονικής διαλδεϋδης (MDA) στον ηπατικό ιστό). Μελέτη 2: Μύες C57BL/6 υποβλήθηκαν σε κανονική δίαιτα (ND) για 20 εβδομάδες ή σε δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά (HFD) με 5% σιρόπι καλαμποκιού υψηλής περιεκτικότητας σε φρουκτόζη (HFCS) για 12 εβδομάδες, ακολουθούμενη από παρεμβάσεις 8 εβδομάδων, συμπεριλαμβανομένου διαιτητικού περιορισμού (DR), αερόβιας άσκησης (EX) ή συνδυασμού δίαιτας και αερόβιας άσκησης (DREX) ή συνέχεια της διατροφής HFD-HFCS χωρίς παρέμβαση. Οι βιοδείκτες κυτταρικής γήρανσης αναλύθηκαν ως προς τα επίπεδα έκφρασης του mRNA τους, ενώ σε τομές ηπατικού ιστού πραγματοποιήθηκαν χρώσεις με GL13, p21 WAF1/CIP1 και p16INK4A . Επιπλέον, διερευνήθηκε η σχέση των βιοδεικτών αυτών με το βαθμό ηπατικής στεάτωσης και ίνωσης. Αποτελέσματα: Μελέτη 1: Και στα δύο μοντέλα, η συσσώρευση λίπους στο ήπαρ και η αυξημένη ηπατική έκφραση mRNA γονιδίων που σχετίζονται με στεάτωση συνοδεύονται από ηπατική γήρανση, με αυξημένη έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με γήρανση και με την παρουσία ισχυρής υβριδικής ανοσοϊστοχημικής χρώσης GL13, ειδικής για τη γήρανση στο ήπαρ. Το μήκος των τελομερών και η συνολική μεθυλίωση του DNA δε διέφεραν μεταξύ του στεατωτικού και του ήπατος της ομάδας ελέγχου, ενώ το MDA, δείκτης οξειδωτικού στρες, ήταν αυξημένο στο ήπαρ των μυών με MASLD. Μελέτη 2: Οι ομάδες DR και DREX εμφάνισαν στατιστικά σημαντική μείωση της παχυσαρκίας και ηπατικής στεάτωσης και ίνωσης που σχετίζονται με τη MASLD. Η μείωση στις ομάδες αυτές ήταν μεγαλύτερη συγκριτικά με την αντίστοιχη βελτίωση που επήλθε μόνο από αερόβια άσκηση (HFDEX). Μια στατιστικά σημαντική αύξηση της έκφρασης mRNA της εξαρτώμενης από κυκλίνη κινάσης p21WAF1/CIP1 ανιχνεύθηκε στο ήπαρ των HFD σε σύγκριση με ND, η οποία επίσης αντιστράφηκε κατά τις παρεμβάσεις που περιλαμβάνουν δίαιτα. Οι ανοσοϊστοχημικές χρώσεις για τα GL13 και p21WAF1/CIP1 επιβεβαίωσαν τις προαναφερθείσες αλλαγές του p21 WAF1/CIP1 σε επίπεδο ιστού, ενώ υπέδειξαν και μία παράλληλη αύξηση της p16INK4a μετά από HFD, η οποία ανεστράφη μόνο στις DR/DREX ομάδες. Συμπέρασμα: Η γήρανση του ήπατος εμπλέκεται στην παθογένεια της νόσου ανεξαρτήτως της προχωρημένης ηλικίας και της παρουσίας παχυσαρκίας. Το φαινόμενο της κυτταρικής γήρανσης ανταποκρίνεται τόσο στην άσκηση όσο και στον διαιτητικό περιορισμό, αλλά η βελτίωσή της στο πλαίσιο της MASLD είναι πιο ισχυρή σε παρεμβάσεις που περιλαμβάνουν διαιτητικό περιορισμό.