Unravelling the mechanisms of endothelial cell adhesion in angiogenesis and cancer

Abstract

The vertebrate vascular system is vital for tissue and organ maintenance. Blood vessels are lined with endothelial cells (ECs) and surrounded by a complex network of extracellular matrix (ECM) and perivascular cells. Endothelial cell adhesion to the ECM plays central role in the formation and function of blood vessels. In pathological conditions such as cancer, blood vessels exhibit various changes in their number or function. Cell-ECM adhesions are critical regulators of several cellular processes including migration, invasion, proliferation and differentiation. The physical attachment of ECs to the ECM is achieved by multiprotein dynamic complexes that directly link ECM integrin receptors to the actin cytoskeleton of the cells, known as the integrin adhesome network (Horton et al. 2015). The ternary complex IPP- composed of ILK, PINCH and Parvin and Talin, are established as major components of this network.Previous studies have shown that complete deletion of ilk, pinch1, parvin, or TLN1 in vivo leads to early embryonic lethality. Regarding their role in the endothelium, in vivo deletion of ilk from ECs caused vascular abnormalities that resulted in embryonic death, indicating a vital role in developmental angiogenesis (Friedrich et al. 2004). The role of PINCH in the vascular endothelium has not been studied yet. As for parvin, total deletion of α-parvin from the ECs leads to embryonic lethality at a late time point, while postnatally, endothelial α-parvin loss results in severe vascular deformities (Fraccaroli et al. 2015a). Likewise, endothelial deletion of talin in vivo, during vascular development, leads to severe vascular defects and early embryonic lethality (Monkley et al. 2011), shaping an indispensable role for talin in embryonic angiogenesis. In this study, we focused our interest on elucidating the roles of ILK’s partner, PINCH and Talin in developmental angiogenesis and further examining the functional importance of ILK and PINCH in pathological angiogenesis, during tumour formation. To accomplish our goals, we utilize two different genetic mouse models, one with an endothelial-specific cre for constitutive deletion and another one with an inducible cre, which allows us to delete talin, ilk, or pinch specifically from ECs in a time-dependent manner, using tamoxifen treatment. Regarding the role of talin in developmental angiogenesis, we utilize a well-established model for de novo angiogenesis, the retina vasculature. Loss of endothelial talin resulted in severe defects at the angiogenic front and reduced vessel branching, compromising the formation and stability in all retinal layers. Regarding PINCH, we investigated the role of both PINCH isoforms, PINCH1 and PINCH2, in developmental and pathological angiogenesis. Specifically, endothelial-specific deletion of PINCH1 during embryogenesis disrupted the vascular network and caused embryonic lethality, indicating its critical role in vascular development. PINCH2 endothelial defective mice were born and did not exhibit any developmental defects. To assess the role of PINCH in pathological angiogenesis, we conducted tumour xenograft experiments. Endothelial-specific deletion of PINCH1 in postnatal mice using the inducible cre mouse model did not affect tumour blood vessel density or structure, but it suppressed tumour growth. In contrast, endothelial-specific deletion of PINCH2 had no impact on tumour angiogenesis or growth. Further experiments are needed to elucidate the functional significance of PINCH in tumour endothelium.Endothelial-specific deletion of ILK significantly suppressed tumour growth and neovascularization in vivo. Detailed structural analysis of EC-ILK ablated tumours revealed dysfunctional vessels that expressed reduced leakage and abnormal ECM deposition. Various ex vivo and in vitro cellular assays and live imaging experiments demonstrated an important role of ILK in regulating EC function. We show that endothelial ILK is essential for cell adhesion stability, cell adhesion site remodelling and maintenance, and integrin-actin linkage reinforcement. Moreover, our in vitro findings revealed a critical role for ILK in EC axial polarity, indicating multiple ways by which ILK affect blood vessel formation and stability.

Το αγγειακό σύστημα αποτελεί ένα ζωτικής σημασίας σύστημα για κάθε ζωντανό οργανισμό. Τα αιμοφόρα αγγεία αποτελούνται από ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία έρχονται σε άμεση επαφή με τη ροή του αίματος και είναι υπεύθυνα για τη διατήρηση της ορθής κυκλοφορίας σε όλα τα όργανα και τους ιστούς κάθε ζωντανού οργανισμού. Ο ρόλος τους αυτός συμπεριλαμβάνει τη συνεχόμενη έκθεσή τους σε μηχανικά ερεθίσματα που προέρχονται από τις επαφές τους με την εξωκυττάρια ύλη που τα περιβάλει, καθώς και από την κυκλοφορία του αίματος. Η αλληλεπίδραση των ενδοθηλιακών κυττάρων με την περιβάλλουσα εξωκυττάρια ύλη είναι καίριας σημασίας για την ορθή λειτουργία των αιμοφόρων αγγείων τόσο σε φυσιολογικές συνθήκες, όσο και σε παθολογικές καταστάσεις όπως ο καρκίνος. Η φυσική προσκόλληση του κυτταροσκελετού των ενδοθηλιακών κυττάρων με την εξωκυττάρια ύλη, επιτυγχάνεται μέσω πολύ-πρωτεϊνικών συμπλόκων που συγκροτούνται στην μεμβράνη των ενδοθηλιακών κυττάρων, γύρω από κεντρικούς διαμεμβρανικούς υποδοχείς που ονομάζονται ιντεγκρίνες. Τα πολύ-πρωτεϊνικά αυτά δίκτυα, αναφερόμενα και ως συνδεόσωμα, αποτελούνται από πληθώρα πρωτεϊνών που ανήκουν σε διάφορες κατηγορίες όπως σηματοδοτικά μόρια, πρωτεΐνες προσαρμοστές, δομικές πρωτεΐνες καθώς και πρωτεΐνες που συνδέονται στον κυτταροσκελετό της ακτίνης. Μέσω όλων αυτών των πρωτεϊνών, που ονομάζονται πρωτεΐνες κυτταρικής προσκόλλησης, τα ενδοθηλιακά κύτταρα ρυθμίζουν όλες τις ζωτικής σημασίας διεργασίες που επιτελούν όπως τη μετανάστευση, τη διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό και το κυτταρικό θάνατο. Στην ομάδα αυτών των πρωτεϊνών ανήκουν η Ταλίνη καθώς και το τριαδικό σύμπλοκο IPP (ILK-PINCH-Parvin), οι ρόλοι των οποίων θα μελετηθούν στη συγκεκριμένη διατριβή. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει τη σημαντικότητα των ilk, pinch1, parvin and TLN1 γονιδίων in vivo ήδη από τα στάδια της εμβρυογένεσης, καθώς ολική απαλοιφή τους από το γονιδίωμα οδηγεί σε εμβρυικό θάνατο. Συγκεκριμένα στα ενδοθηλιακά κύτταρα, in vivo απαλοιφή της ILK έχει ως αποτέλεσμα τον θάνατο στην εμβρυική ηλικία ύστερα από σοβαρές δυσμορφίες των αιμοφόρων αγγείων. Αντίστοιχα, ενδοθηλιακή απαλοιφή του γονιδίου της α-parvin κατά την εμβρυική ζωή αλλά και μεταγεννητικά οδηγεί σε θάνατο λόγω αλλοιώσεων και δυσμορφιών των αιμοφόρων αγγείων. Παρόμοια με την ILK και την α-parvin, ενδοθηλιακή διαγραφή του γονιδίου της ταλίνης, οδηγεί σε πρόωρο εμβρυικό θάνατο σε πολύ πρώιμο στάδιο της εμβρυογένεσης εξαιτίας της δημιουργίας εκτεταμένων δυσμορφιών στα αγγεία. Η συμβολή της PINCH στο ενδοθήλιο παραμένει αδιερεύνητη. Στη συγκεκριμένη μελέτη επικεντρωθήκαμε στη διερεύνηση του ρόλου της PINCH στην εμβρυική αγγειογένεση καθώς και του ρόλου της ταλίνης στον σχηματισμό των αγγείων de novo μεταγεννητικά. Επιπλέον, μελετήθηκε ο ρόλος της ILK και της PINCH στην παθολογική αγγειογένεση κατά τη δημιουργία των αγγείων σε όγκους απουσία των πρωτεϊνών αυτών από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Για την επίτευξη των παραπάνω στόχων, χρησιμοποιήθηκαν γενετικά τροποποιημένα μοντέλα ποντικιών για την ιστοειδική απαλοιφή των ανωτέρω γονιδίων από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, είτε συνεχόμενα, είτε χρονοειδικά, χρησιμοποιώντας ταμοξιφαίνη. Τα αποτελέσματα που αφορούν τη μελέτη της αγγειογένεσης κατά την ανάπτυξη, έδειξαν ότι η ενδοθηλιακή απαλοιφή της PINCH1 κατά την εμβρυογένεση οδηγεί σε πρόωρο εμβρυικό θάνατο λόγω εκτεταμένων αλλοιώσεων του αγγειακού δικτύου. Αντίθετα, τα έμβρυα ποντικών που φέρουν ενδοθηλιακή απαλοιφή της PINCH2 γεννιούνται κανονικά χωρίς να παρουσιάζουν αναπτυξιακές ανωμαλίες. Όσον αναφορά στην ταλίνη, μελετήσαμε την ανάπτυξη των αγγείων στον αμφιβληστροειδή χιτώνα του ματιού, ύστερα από διαγραφή της ταλίνης χρονοειδικά, για την ανάλυση συγκεκριμένων αγγειογενετικών σταδίων. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν σοβαρές δυσμορφίες των αιμοφόρων αγγείων στις περιοχές της αγγειογεννετικής εκβλάστησης με τη δημιουργία συσσωματωμάτων ενδοθηλιακών κυττάρων, καθώς και μειωμένων αγγειακών διακλαδώσεων. Επιπρόσθετες δυσλειτουργίες των αγγείων παρουσιάστηκαν σε μετέπειτα αναπτυξιακά στάδια όπου παρατηρήθηκε παρεμπόδιση της μετανάστευσης και εισχώρησης των αγγείων για το σχηματισμό των επιπρόσθετων τμημάτων του αμφιβληστροειδούς. Τέλος, η ενδοθηλιακή απαλοιφή της ταλίνης προκάλεσε ανεπαρκή αναδιαμόρφωση των αγγείων στα τελικά στάδια σχηματισμού του αμφιβληστροειδούς πριν επέλθει η αγγειακή ομοιόσταση. Για τη μελέτη των πρωτεϊνών ILK και PINCH1/2 στην παθολογική αγγειογένεση, χρησιμοποιήθηκαν μοντέλα ξενομοσχευμάτων καρκινικών κυττάρων σε ποντίκια, ύστερα από απαλοιφή των εκάστοτε πρωτεϊνών. Τα πειράματα αυτά έδειξαν ότι η ιστοειδική απαλοιφή της ILK προκαλεί μείωση του μεγέθους των όγκων καθώς και του αριθμού των αγγείων σ’ αυτούς. Αναλυτική μελέτη της μορφολογίας του καρκινικού αγγειακού δικτύου κατέδειξε μη φυσιολογικό σχηματισμό των αγγείων στους όγκους με ενδοθηλιακή απαλοιφή της ILK καθώς και δυσχέρεια στη ροή των αγγείων αυτών. Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκε μειωμένη διαρροή των αγγείων αυτών αλλά και μη φυσιολογικός προσανατολισμός και σύσταση της εξωκυττάριας ύλης. Σχετικά με το ρόλο των πρωτεϊνών PINCH1 και PINCH2, αντίστοιχα πειράματα έδειξαν μείωση των σχηματιζόμενων όγκων ύστερα από ενδοθηλιακή απαλοιφή της PINCH1 χωρίς μείωση του αριθμού των αγγείων, ενώ ενδοθηλιακή απαλοιφή της PINCH2 δεν έδειξε αλλαγές στο μέγεθος ούτε και στον αριθμό των αγγείων. Ύστερα από ανάλυση της μορφολογίας των αγγείων αυτών, δεν παρατηρήθηκαν ιδιαίτερες διαφορές που να οφείλονται στην έλλειψη της PINCH1 ή της PINCH2 από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Συνοψίζοντας, ενδοθηλιακή απαλοιφή της ILK οδηγεί σε σημαντική μείωση του μεγέθους των νεοσχηματιζόμενων όγκων καθώς και των αγγείων αυτών. Μορφολογική ανάλυση των αγγείων αυτών έδειξε μη λειτουργικά αγγεία με μειωμένη διαπερατότητα και μη ομοιόμορφη εναπόθεση της εξωκυττάριας ύλης σ’αυτά. Ποικιλία ex-vivo και in-vitro κυτταρικών δοκιμασιών και τεχνικές απεικόνισης ζωντανών ενδοθηλιακών κυττάρων έδειξαν την ιδιαίτερη σημασία της πρωτεΐνης ILK στη ρύθμιση της κυτταρικής λειτουργίας. Δείξαμε ότι η ILK είναι απαραίτητη για την διατήρηση και την αναδιαμόρφωση των θέσεων κυτταρικής προσκόλλησης, καθώς και για την ενίσχυση της πρόσδεσης των ιντεγκρινών στον κυτταροσκελετό της ακτίνης. Τέλος, επιπρόσθετες in vitro μελέτες μας έδειξαν την ενεργή συμμετοχή της ILK στην σταθεροποίηση του δικτύου των μικροσωληνίσκων στην περιφέρεια των ενδοθηλιακών κυττάρων καθώς και στην διατήρηση της πολικότητας των ενδοθηλιακών κυττάρων αναδεικνύοντας πολλαπλούς τρόπους, μέσω των οποίων η ILK επηρεάζει το σχηματισμό καθώς και τη σταθερότητα των αιμοφόρων αγγείων.