Study of the effect of empagliflozin on an experimental murine model of metabolic associated fatty liver disease

Abstract

Introduction: Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), recently renamed as metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD), affects approximately one-third of the global population and is particularly prevalent in individuals with type 2 diabetes and obesity. This condition, which ranges from simple steatosis to steatohepatitis, hepatic fibrosis and cirrhosis, poses a significant health challenge due to its potential to progress to severe liver damage. Given the increasing prevalence of NAFLD and the limited available treatment options, there is an urgent need for effective prevention and treatment strategies. Sodium-glucose co-transporter 2 inhibitors (SGLT-2i) have emerged as potential therapeutic agents, due to their unique mechanism of action, which lowers blood glucose levels by inhibiting renal glucose reabsorption and promoting weight loss. While some SGLT-2i have shown favorable cardiovascular and renal effects, their specific impact on hepatic steatosis, inflammation, and fibrosis in NAFLD remains largely unclear, necessitating further research to determine their therapeutic efficacy.Aim: Τhe present dissertation aimed to evaluate the potential preventive effects of empagliflozin, a SGLT-2i approved for the treatment of type 2 diabetes mellitus, on both the histological and lipidomic profiles of a mouse model fed a fast food diet (FFD). Methods: A total of 24 C57BL/6J mice of both sexes, aged eight to nine weeks, were randomly divided into three groups: a FFD group (n=8), receiving a high-fat, high-cholesterol, high-fructose diet; an EMPA group (n=8), receiving the same FFD with 10 mg/kg/day empagliflozin; and a chow diet (CD) group (n=8) as control group. Mice were weighed, and blood samples were collected every 4 weeks to measure glucose, alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, triglycerides, and total cholesterol. After 25 weeks, the mice were euthanized, and liver tissues were collected for histological evaluation and lipidomics analysis via ultra-performance liquid chromatography coupled to time-of-flight mass spectrometry in tandem (UPLC-TOF-MS/MS).Results: After 25 weeks, there was no significant difference in body weight between the three groups, whereas liver-to-body weight ratio was greater in the EMPA compared to the CD group (p = 0.002). Hepatic fibrosis was marginally different between the three groups (p = 0.045). Fibrosis stage 1 was present in five mice on FFD (62.5%), in one mouse on EMPA (12.5%), and in one mouse on CD (12.5%). Lipogenic, inflammatory, and fibrogenic genes did not differ between the EMPA and FFD groups. Interestingly, mRNA encoding for SGLT-1 and SGLT-2 was detected in the mouse livers. Following untargeted lipidomics analysis, FFD and EMPA groups displayed similar serum lipid profiles, characterized by elevated levels in the majority of identified lipids, particularly glycerophospholipids, compared to the CD group. Conversely, hepatic lipid profiles varied more significantly between the groups. For example, phosphatidylcholine (PC), phosphatidylinositol (PI), and phosphatidylglycerol demonstrated mixed trends in the FFD and EMPA groups compared to the CD group. FFD appears to have a more substantial impact on lipidomic profiles compared to the preventive empagliflozin effect (CV ANOVA=3.43×10⁻6 FFD vs. CD; 7.67 × 10⁻7 EMPA vs. CD; 2.00 × 10⁻2 EMPA vs. FFD). Interestingly, several glycerophospholipids, including PC 34:1, PC 35:1, PC 36:3, PC 38:4, PI 34:2 and PI 38:3, increased in both serum and hepatic tissues of the FFD and EMPA groups compared to the CD group.Conclusions: Empagliflozin treatment in mice on a FFD did not result in any significant effects on morphological, biochemical, or histological features or on the expression of hepatic genes associated with NAFLD compared to those fed a FFD without empagliflozin. The observed effects on mild hepatic fibrosis warrant validation, possibly via studies of longer duration. Additionally, the EMPA group had largely similar lipidomic profile compared to FFD group. However, both EMPA and FFD groups showed distinct lipidomic profiles compared to the CD group.

Εισαγωγή: Η μη αλκοολική λιπώδης νόσος του ήπατος (nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD) έχει πρόσφατα μετονομαστεί σε σχετιζόμενη με τη μεταβολική δυσλειτουργία στεατωτική ηπατική νόσος (metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease, MASLD) και επηρεάζει περίπου το ένα τρίτο του παγκόσμιου πληθυσμού και είναι ιδιαίτερα συχνή σε άτομα με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 και παχυσαρκία. Η κατάσταση αυτή, η οποία κυμαίνεται από απλή στεάτωση έως στεατοηπατίτιδα, ίνωση και κίρρωση ήπατος, αποτελεί σημαντική πρόκληση για τη δημόσια υγεία, λόγω του κινδύνου εξέλιξης σε σοβαρή ηπατική βλάβη. Δεδομένου του αυξανόμενου επιπολασμού της NAFLD και των περιορισμένων διαθέσιμων θεραπευτικών επιλογών, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για αποτελεσματικές στρατηγικές πρόληψης και θεραπείας. Οι αναστολείς του συμμεταφορέα νατρίου-γλυκόζης 2 (sodium-glucose co-transporter 2 inhibitors, SGLT-2i) έχουν αναδειχθεί ως δυνητικοί θεραπευτικοί παράγοντες, χάρη στο μοναδικό μηχανισμό δράσης τους, ο οποίος μειώνει τα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα μέσω της αναστολής της νεφρικής επαναρρόφησης γλυκόζης και της προαγωγής της απώλειας βάρους. Παρόλο που ορισμένοι SGLT-2i έχουν δείξει ευνοϊκά καρδιαγγειακά και νεφρικά αποτελέσματα, η επίδρασή τους στη στεάτωση, τη φλεγμονή και την ίνωση του ήπατος στη NAFLD παραμένει ασαφής, απαιτώντας περαιτέρω έρευνα για τον προσδιορισμό της θεραπευτικής τους αποτελεσματικότητας. Σκοπός: Η παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει να αξιολογήσει τις πιθανές προληπτικές επιδράσεις της εμπαγλιφλοζίνης, ενός εγκεκριμένου SGLT-2i για τη θεραπεία του σακχαρώδους διαβήτη τύπου 2, τόσο στο ιστολογικό προφίλ όσο και στο λιπιδίωμα του ορού και του ήπατος σε ένα διατροφικό μοντέλο μυός με MASLD. Μέθοδοι: Συνολικά, 24 μύες C57BL/6J (άρρενες και θήλεις), ηλικίας 8-9 εβδομάδων, ταξινομήθηκαν με τυχαιοποίηση σε τρεις ομάδες: την ομάδα δίαιτας τύπου fast food (fast food diet, FFD) (n=8), που έλαβε δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά, χοληστερόλη και φρουκτόζη, την ομάδα EMPA (n=8), που έλαβε την ίδια δίαιτα μαζί με 10 mg/kg/ημέρα εμπαγλιφλοζίνης και την ομάδα ελέγχου (n=8), που έλαβε συμβατική τροφή (chow diet, CD). Μέτρηση βάρους και αιμοληψία πραγματοποιούνταν κάθε 4 εβδομάδες για τη μέτρηση της γλυκόζης, της αλανινικής αμινοτρανσφεράσης (ALT), της ασπαρτικής αμινοτρανσφεράσης (AST), των τριγλυκεριδίων και της ολικής χοληστερόλης. Μετά από 25 εβδομάδες οι μύες υποβλήθηκαν σε ευθανασία, οπότε διενεργήθηκε ιστολογική εξέταση και ανάλυση λιπιδομικής μέσω υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης συνδυασμένης με φασματομετρία μάζας (UPLC-TOF-MS/MS). Αποτελέσματα: Μετά από 25 εβδομάδες, δεν υπήρξε σημαντική διαφορά στο σωματικό βάρος μεταξύ των τριών ομάδων, ενώ ο λόγος του βάρους ήπατος προς το σωματικό βάρος ήταν υψηλότερος στην ομάδα EMPA σε σύγκριση με την ομάδα CD (p = 0.002). Η ηπατική ίνωση διέφερε οριακά μεταξύ των ομάδων (p = 0.045), με το στάδιο ίνωσης 1 να ανιχνεύεται σε πέντε μύες της ομάδας FFD (62.5%), σε έναν μυ της ομάδας EMPA (12.5%) και σε έναν μυ της ομάδας CD (12.5%). Γονίδια που σχετίζονται με στεάτωση, φλεγμονή και ίνωση δε διέφεραν μεταξύ των ομάδων EMPA και FFD. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι ανιχνεύτηκε mRNA των SGLT-1 και SGLT-2 στο ήπαρ των μυών. Επιπλέον, η μη-στοχευμένη ανάλυση λιπιδομικής αποκάλυψε παρόμοιο προφίλ λιπιδίων ορού μεταξύ των ομάδων FFD και EMPA, που χαρακτηρίζονταν από αυξημένα επίπεδα στην πλειονότητα των ταυτοποιημένων λιπιδίων, ιδίως των γλυκεροφωσφολιπιδίων, συγκριτικά με την ομάδα CD. Αντίθετα, τα ηπατικά λιπιδομικά προφίλ εμφάνισαν σημαντικότερες διαφορές μεταξύ των ομάδων. Για παράδειγμα, η φωσφατιδυλοχολίνη (PC), η φωσφατιδυλινοσιτόλη (PI) και η φωσφατιδυλογλυκερόλη (PG) παρουσίασαν μικτές τάσεις στις ομάδες FFD και EMPA σε σύγκριση με την ομάδα CD. Γενικώς, η δίαιτα τύπου FFD είχε μεγαλύτερη επίδραση στο λιπιδομικό προφίλ, γεγονός που η προληπτική χορήγηση εμπαγλιφλοζίνης δεν ανέστειλε (CV ANOVA=3.43×10⁻6 FFD έναντι CD; 7.67 × 10⁻7 EMPA έναντι CD; 2.00 × 10⁻2 EMPA έναντι FFD). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι αρκετά γλυκεροφωσφολιπίδια, συμπεριλαμβανομένων των PC 34:1, PC 35:1, PC 36:3, PC 38:4, PI 34:2 και PI 38:3, αυξήθηκαν, τόσο στον ορό, όσο και στο ήπαρ των ομάδων FFD και EMPA σε σύγκριση με την ομάδα CD. Συμπεράσματα: Η θεραπεία με εμπαγλιφλοζίνη σε μύες που έλαβαν FFD δεν επέφερε σημαντικές αλλαγές στα μορφολογικά, βιοχημικά ή ιστολογικά χαρακτηριστικά, ούτε στην έκφραση ηπατικών γονιδίων που σχετίζονται με τη NAFLD σε σύγκριση με εκείνα που έλαβαν FFD χωρίς εμπαγλιφλοζίνη. Η παρατηρούμενη πιθανή επίδραση της εμπαγλιφλοζίνης στην ήπια ηπατική ίνωση χρήζει επιβεβαίωσης, ενδεχομένως σε μελέτες μεγαλύτερης διάρκειας. Επιπλέον, στην ομάδα EMPA διαπιστώθηκε παρόμοιο λιπιδομικό προφίλ σε σύγκριση με την ομάδα FFD. Ωστόσο, τόσο η ομάδα EMPA όσο και η ομάδα FFD παρουσίασαν διακριτά λιπιδομικά προφίλ σε σύγκριση με την ομάδα CD.