Move, adapt or die: οι εξώθερμοι οργανισμοί των άκρων και η πρόκληση της κλιματικής αλλαγής: η περίπτωση της Podarcis cretensis

Abstract

The aim of the PhD thesis is to apply a new holistic approach, based on ecological and genomic information, in order to estimate the biological responses of organisms to environmental changes, such as climate change, in a clear spatial context. The study of the evolutionary adaptations of organisms to different thermal environments, the elucidation of the effects of adaptation and phenotypic plasticity, the population structure and the determination of their risk status against climate change, will contribute significantly to the definition of management frameworks for ectothermic organisms in the Mediterranean “extreme” environments.For this purpose, populations of the species Podarcis cretensis (Sauria, Lacertidae), which is an endemic lizard species of Crete and its satellite islets, were used as a model ectothermic organism. The main study populations came from two "edge" environments of the species' distribution in terms of climatic conditions (mountain peaks with an altitude of more than 2.000 m and rocky islands with an area of less than 15 hectares) and an "intermediate" (~1.000 m altitude mainland), aiming to evaluate the effectiveness of a framework, which will study the adaptation of populations to local conditions and which can be applied to other organisms and regions of the planet.The multi-level scientific approach applied included the use of cutting-edge technologies (Next Generation Sequencing and a multitude of bioinformatics tools) to reveal the genetic profile of the organism through the study of the genome [SNPs through Double-digest Restriction site associated DNA sequencing (ddRADseq)], its transcriptome (RNAseq via cDNA library generation), its thermal biology (preferred temperatures, functional temperatures, body temperatures, markers linking climate variables and thermal biology) and its ecology (linking environmental markers to genome)], combined with common garden experiments where the two edge populations were adapted to opposite temperature stimuli than those to which they are adapted.The study of the thermal biology of the species by determining critical temperatures (CT), preferred temperatures (Tpref), body temperatures (Tb) and operative temperatures (Te) of various populations, showed that P. cretensis falls under the “static” thermoregulatory pattern, which combined with findings on the thermoregulatory effectiveness of populations and indices related to thermal critical thresholds led to the assessment that the populations of Chrysi and Mikronisi are particularly vulnerable to the ongoing climate change.Through SNPs, the population structure of the species was examined in which there is a genetic separation between the eastern and western populations, genetic loci that are potentially under selection (outliers loci) were identified with different methods (RDA, gINLAnd, PCAdapt), whose results confirmed population differentiation at different altitudes, identified 537 outliers loci, and revealed that factors such as annual temperature range, average monthly precipitation of the warmest quarter, and habitat type drive natural selection. Furthermore, in the two "edge" environments of the species' distribution, genetic diversity appears to be influenced by the seasonality of precipitation and the mean daily temperature of the warmest quarter.The study of the transcriptome revealed differential expression of many proteins between the extreme populations and the intermediate, but also differential expression after adaptation to different temperature stimuli. In this way, differences in the expression of various genes related to adaptation to temperature stress were revealed, such as those of heat shock (HSPs) proteins. At the same time, it was found that in the cells of the liver and brain there are the greatest differences in gene expression between the individuals from the islet (Mikronisi Chrysis) and those from the summit of Rousies of the White Mountains, while fewer differences were found between them and the intermediate population (Theriso).This work, which is the first attempt in the Aegean of a unified approach with genomic, physiological and ecological elements recovered both from natural populations and from common garden experiments, demonstrated the different possibilities of adaptation of the two "edge" populations to changing conditions and the possibilities of specific research context in capturing the complex relationships between genotype, phenotype and environment.

Ο στόχος της διδακτορικής διατριβής είναι η εφαρμογή μιας νέας ολιστικής προσέγγισης, βασιζόμενης σε στοιχεία οικολογίας και γενωμικής, με σκοπό την εκτίμηση των βιολογικών αποκρίσεων των οργανισμών στις περιβαλλοντικές αλλαγές, όπως η κλιματική αλλαγή, σε ένα σαφές χωρικό πλαίσιο. Η μελέτη των εξελικτικών προσαρμογών των οργανισμών σε διαφορετικά θερμικά περιβάλλοντα, η αποσαφήνιση των επιδράσεων της προσαρμογής και της φαινοτυπικής πλαστικότητας, η πληθυσμιακή δομή και ο καθορισμός της κατάστασης τρωτότητάς τους έναντι της κλιματικής αλλαγής, θα συνεισφέρει σημαντικά στον καθορισμό πλαισίων διαχείρισης των εξώθερμων οργανισμών σε μεσογειακά «ακραία» περιβάλλοντα. Για το σκοπό αυτό, ως μοντέλο εξώθερμου οργανισμού χρησιμοποιήθηκαν πληθυσμοί του είδους κλωστιδάκι (Podarcis cretensis - Sauria, Lacertidae) το οποίο αποτελεί ενδημικό είδος σαύρας της Κρήτης και των δορυφορικών της νησίδων. Οι κύριοι πληθυσμοί μελέτης προήλθαν από δύο «ακραία» περιβάλλοντα της κατανομής του είδους όσον αφορά τις κλιματικές συνθήκες (κορυφές βουνών με υψόμετρο μεγαλύτερο των 2.000 m και βραχονησίδες με έκταση μικρότερη των 15 εκταρίων) και ένα «ενδιάμεσο» (~1.000 m υψόμετρο στην ενδοχώρα), στοχεύοντας στην αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας μιας μεθοδολογίας η οποία θα μελετά την προσαρμογή των πληθυσμών σε τοπικές συνθήκες και που θα μπορεί να εφαρμοστεί και σε άλλους οργανισμούς και περιοχές του πλανήτη. Η πολυεπίπεδη επιστημονικά προσέγγιση που εφαρμόστηκε, περιλάμβανε τη χρήση τεχνολογιών αιχμής (Next Generation Sequencing και πληθώρα βιοπληροφορικών εργαλείων) για την αποκάλυψη του γενετικού προφίλ του οργανισμού μέσω της μελέτης του γονιδιώματος [SNPs μέσω της Double-digest Restriction site associated DNA sequencing (ddRADseq)], του μεταγραφώματος (RNAseq μέσω δημιουργίας cDNA βιβλιοθηκών), της θερμικής βιολογίας του (επιλεγόμενες θερμοκρασίες, λειτουργικές θερμοκρασίες, θερμοκρασίες σώματος, δείκτες σύνδεσης κλιματικών μεταβλητών και θερμικής βιολογίας) και της οικολογίας του (σύνδεση περιβαλλοντικών δεικτών με γονιδίωμα)], σε συνδυασμό με πειράματα κοινού περιβάλλοντος όπου οι δύο ακραίοι πληθυσμοί εγκλιματίστηκαν σε αντίθετες θερμοκρασιακές συνθήκες από αυτές που είναι προσαρμοσμένοι. Η μελέτη της θερμικής βιολογίας του είδους με τον προσδιορισμό των κρίσιμων θερμοκρασιών (CT), των επιλεγόμενων θερμοκρασιών των διάφορων πληθυσμών (Tpref), των θερμοκρασιών σώματος (Tb) και των λειτουργικών θερμοκρασιών (Τe) έδειξε ότι η P. cretensis εμπίπτει στο «στατικό» θερμορυθμιστικό πρότυπο, κάτι το οποίο συνδυαστικά με τα ευρήματα για την αποτελεσματικότητα της θερμορύθμισης των επιμέρους πληθυσμών και των δεικτών που σχετίζονται με τα θερμικά κρίσιμα όρια οδήγησαν στην εκτίμηση ότι οι πληθυσμοί της Χρυσής και του Μικρονησίου είναι ιδιαίτερα ευάλωτοι στη συνεχιζόμενη κλιματική αλλαγή. Μέσω των SNPs εξετάστηκε η πληθυσμιακή δομή του είδους στην οποία υπάρχει γενετικός διαχωρισμός μεταξύ των ανατολικών και δυτικών πληθυσμών, ταυτοποιήθηκαν γενετικοί τόποι που βρίσκονται εν δυνάμει υπό επιλογή (αποκλίνοντες γενετικοί τόποι, outliers loci) με διαφορετικές μεθόδους (RDA, gINLAnd, PCAdapt), των οποίων τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν τη διαφοροποίηση των πληθυσμών στα διαφορετικά υψόμετρα, ανέδειξαν 537 αποκλίνοντες γενετικούς τόπους και αποκάλυψαν ότι παράγοντες όπως το ετήσιο εύρος θερμοκρασίας, η μέση μηνιαία ποσότητα βροχόπτωσης του θερμότερου τριμήνου και o τύπος ενδιαιτήματος κατευθύνουν τη φυσική επιλογή. Επιπλέον, στα δύο «ακραία» περιβάλλοντα της κατανομής του είδους, η γενετική ποικιλότητα φαίνεται να επηρεάζεται από την εποχικότητα των βροχοπτώσεων και τη μέση ημερήσια θερμοκρασία του θερμότερου τριμήνου. Η μελέτη του μεταγραφώματος αποκάλυψε διαφορική έκφραση πολλών πρωτεϊνών μεταξύ των ακραίων πληθυσμών και του ενδιάμεσου, αλλά και διαφορική έκφραση μετά από προσαρμογή σε διαφορετικές θερμοκρασιακές συνθήκες. Με αυτό τον τρόπο αποκαλύφθηκαν διαφορές στην έκφραση διαφόρων γονιδίων που σχετίζονται με την προσαρμογή στο θερμοκρασιακό στρες, όπως αυτά των πρωτεϊνών θερμικού σοκ (ΗSPs). Παράλληλα βρέθηκε ότι στα κύτταρα του ήπατος και του εγκεφάλου υπάρχουν οι μεγαλύτερες διαφορές στην έκφραση γονιδίων μεταξύ των ατόμων από τη βραχονησίδα (Μικρονήσι Χρυσής) και αυτών από την κορυφή Ρουσιές των Λευκών Ορέων, ενώ βρέθηκαν λιγότερες διαφορές μεταξύ αυτών και του ενδιάμεσου πληθυσμού (Θέρισο). Η εργασία αυτή που αποτελεί την πρώτη προσπάθεια στο Αιγαίο μιας ενοποιημένης προσέγγισης με γενωμικά, φυσιολογικά και οικολογικά στοιχεία που προέρχονται τόσο από φυσικούς πληθυσμούς όσο και από πειράματα κοινού περιβάλλοντος, κατέδειξε τη διαφορετικές δυνατότητες προσαρμογής των δύο «ακραίων» πληθυσμών σε μεταβαλλόμενες συνθήκες και τις δυνατότητες του συγκεκριμένου πλαισίου έρευνας στην αποτύπωση των περίπλοκων σχέσεων μεταξύ γονοτύπου, φαινοτύπου και περιβάλλοντος.