Solid-phase proximity ligation assays: high-performance and multiplex protein analyses

Abstract

Protein biomarkers circulating in blood hold the promise of improved diagnosis, prognosis and follow-up of treatment of disease via minimally invasive procedures. For the discovery and validation of such biomarkers, methods are needed that can facilitate parallel, highly specific and in-depth analysis of the blood proteome. The work presented in this thesis intends to develop and apply such assays, building on the concept of the proximity ligation assay (PLA). In paper I, I present an easy and non-expensive alternative for the conjugation of oligonucleotides to antibodies via biotin-streptavidin-biotin interaction. This approach can be used when large sets of antibodies and/or oligos need to be validated for their performance as probes in PLA reactions. In paper II, a solid-phase variant of PLA (SP-PLA) for the detection and quantification of proteins in blood is presented. SP-PLA exhibited an improved limit of detection compared to commercial ELISA assays by two orders of magnitude. In addition SP-PLA exhibited a broader dynamic range by at least one order of magnitude and required only 5 µl of sample, rendering the method very well suited for analyses of precious bio-banked material. Last but not least, SP-PLA was used to validate the diagnostic potential of GDF-15 as a biomarker for cardiovascular disease in a set of cardiovascular disease patients and healthy controls. Paper III discusses the development of a multiplex SP-PLA (MultiPLAγ) for the simultaneous detection of 36 proteins in just 5 µl of sample. MultiPLAγ exhibited an improved LOD when compared to state-of-the-art bead-based sandwich assays. Most importantly, we observed only a minimal tendency to increased background with multiplexing, compared to a sandwich assay, suggesting that much higher levels of multiplexing will be possible. The assay was used to identify putative biomarkers in sample cohorts of colorectal cancer (CRC) and cardiovascular disease (CVD). Subsequent multivariate analysis revealed previously known diagnostic biomarkers. Furthermore, we successfully applied next-generation sequencing as a readout for the protein assays, allowing for the first time digital recording of protein profiles in blood. In paper IV, we investigated the suitability of prostasomes as blood biomarkers in patients with prostate cancer using a newly developed PLA assay (4PLA) that utilizes five binders for the detection of complex target molecules. The assay successfully detected significantly elevated levels of prostasomes in blood samples from prostate cancer patients prior to radical prostatectomy, compared to controls and men with benign biopsy results.

Πρωτεϊνικοί βιοδείκτες που κυκλοφορούν στο αίμα υπόσχονται βελτιωμένη διάγνωση, πρόγνωση και παρακολούθηση της θεραπείας ασθενειών μέσω ελάχιστα επεμβατικών διαδικασιών. Για την ανακάλυψη και επικύρωση τέτοιων βιοδεικτών, απαιτούνται μέθοδοι που μπορούν να διευκολύνουν την παράλληλη, εξαιρετικά ειδική και σε βάθος ανάλυση του πρωτεώματος του αίματος. Η εργασία που παρουσιάζεται σε αυτή τη διατριβή σκοπεύει στην ανάπτυξη και εφαρμογή τέτοιων δοκιμασιών, βασιζόμενη στην αρχή της δοκιμασίας προσδέσεων εγγύτητας (proximity ligation assay - PLA). Στην εργασία I, παρουσιάζω μια εύκολη και μη δαπανηρή εναλλακτική λύση για τη σύζευξη ολιγονουκλεοτιδίων με αντισώματα μέσω αλληλεπίδρασης βιοτίνης-στρεπταβιδίνης-βιοτίνης. Αυτή η προσέγγιση μπορεί να χρησιμοποιηθεί όταν απαιτείται η επικύρωση μεγάλων συνόλων αντισωμάτων και/ή ολιγομερών για την απόδοσή τους ως ανιχνευτές σε αντιδράσεις PLA. Στην εργασία II, παρουσιάζεται μια παραλλαγή του PLA σε στερεά φάση (solid-phase PLA - SP-PLA) για την ανίχνευση και ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών στο αίμα. Η δοκιμασία SP-PLA εμφάνισε βελτιωμένο όριο ανίχνευσης κατά δύο τάξεις μεγέθους σε σύγκριση με εμπορικές δοκιμασίες ELISA. Επιπλέον, το SP-PLA εμφάνισε ευρύτερο δυναμικό εύρος κατά τουλάχιστον μία τάξη μεγέθους και απαιτούσε μόνο 5 μl δείγματος, καθιστώντας τη μέθοδο πολύ κατάλληλη για αναλύσεις πολύτιμου υλικού από βιοτράπεζες. Τέλος, το SP-PLA χρησιμοποιήθηκε για την επικύρωση του διαγνωστικού δυναμικού του GDF-15 ως βιοδείκτη για καρδιαγγειακή νόσο σε ένα σύνολο ασθενών με καρδιαγγειακή νόσο και υγιών ατόμων (μαρτύρων). Η εργασία III συζητά την ανάπτυξη μιας πολλαπλής SP-PLA (MultiPLAγ) για την ταυτόχρονη ανίχνευση 36 πρωτεϊνών σε μόλις 5 μl δείγματος. Το MultiPLAγ εμφάνισε βελτιωμένο LOD σε σύγκριση με τις σύγχρονες δοκιμασίες "σάντουιτς" βασισμένες σε μικροσφαιρίδια. Το πιο σημαντικό, παρατηρήσαμε μια ελάχιστη μόνο τάση για αύξηση του υποβάθρου με την πολλαπλή ανάλυση, σε σύγκριση με μια δοκιμασία "σάντουιτς", υποδηλώνοντας ότι είναι δυνατά πολύ υψηλότερα επίπεδα πολλαπλής ανάλυσης. Η δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό πιθανών βιοδεικτών σε ομάδες δειγμάτων ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) και καρδιαγγειακή νόσο (CVD). Η επακόλουθη πολυμεταβλητή ανάλυση αποκάλυψε διαγνωστικούς βιοδείκτες που ήταν ήδη γνωστοί. Επιπλέον, εφαρμόσαμε με επιτυχία την αλληλούχιση επόμενης γενιάς ως μέθοδο ανάγνωσης για τις πρωτεϊνικές δοκιμασίες, επιτρέποντας για πρώτη φορά την ψηφιακή καταγραφή πρωτεϊνικών προφίλ στο αίμα. Στην εργασία IV, διερευνήσαμε την καταλληλότητα των προστασωμάτων ως βιοδεικτών αίματος σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη, χρησιμοποιώντας μια πρόσφατα αναπτυγμένη δοκιμασία PLA (4PLA) που χρησιμοποιεί πέντε συνδετικά για την ανίχνευση πολύπλοκων μορίων-στόχων. Η δοκιμασία ανίχνευσε με επιτυχία σημαντικά αυξημένα επίπεδα προστασωμάτων σε δείγματα αίματος από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη πριν από τη ριζική προστατεκτομή, σε σύγκριση με τους μάρτυρες και τους άνδρες με καλοήθη αποτελέσματα βιοψίας.