Συγκριτική -ωμική μελέτη του δευτερογενούς μεταβολισμού μυκητόφιλων μυκήτων της τάξης Hypocreales

Abstract

This doctoral dissertation focuses on the investigation and elucidation of the molecular and metabolic mechanisms associated with fungicolous behavior and microbial antagonism, with particular emphasis on the secondary metabolism of the fungicolous fungi belonging to the order Hypocreales.Fungi of the order Hypocreales engage in a broad range of interactions with diverse organisms. A specific group of species within the family Hypocreaceae develops fungicolous interactions with basidiomycetes, colonizing both wild and cultivated mushrooms, and thus, causing significant crop losses in edible mushroom production. Diseases caused by fungicolous fungi such as (a) Cladobotryum spp., (b) Mycogone spp., (c) Trichoderma spp., and (d) Zarea spp. severely impact both yield and quality in mushroom farming. Understanding the genetic mechanisms activated during fungus–fungus interactions is essential for enhancing mushroom cultivation efficiency through environmentally friendly approaches.Fungicolous species are characterized by a rich and diverse secondary metabolism, which is closely linked to their lifestyle. However, the mechanisms underlying the interaction between fungicolous species and their basidiomycete hosts, as well as the arsenal of secondary metabolites deployed in these competitive relationships, remain largely unexplored. This dissertation aims to bridge that knowledge gap, focusing on a comparative multi-omics study of the fungicolous lifestyle. The research was structured into the following main sections:a. Collection and molecular identification of fungicolous fungal strainsTwenty-four fungicolous fungal strains were isolated from infected basidiocarps of Agaricus bisporus and Pleurotus spp., as well as from associated substrates and casing materials. The strains were identified at the species level by sequencing the ITS1–5.8S–ITS2 region of the nuclear ribosomal repeat unit and the rpb2 gene, which encodes the second largest subunit of RNA polymerase II. These isolates served as valuable material for studying fungicolous interactions.b. Study of Greek Cladobotryum strainsIn this dissertation, molecular data from 32 Greek Cladobotryum strains from the ATHUM fungal collection were analysed as part of a polyphasic approach combining morphological, molecular, and chemotaxonomic data. Morphological characterization was conducted at the Fungal Taxonomy Laboratory of Department of Biology, NKUA, under Assoc. Prof. Z. Gonou-Zagou, chemotaxonomic profiling by PhD candidate Nikola Milic in the laboratory of Assoc. Prof. Nikolaos Fokialakis (Department of Pharmacy, NKUA), and molecular phylogenetic analysis within the framework of this dissertation. This investigation revealed the genus Cladobotryum to possess a rich and diverse secondary metabolism (Milic et al. 2022).c. In-house whole-genome sequencing of six fungicolous fungal species and comparative genomic analysisSix novel complete genomes were sequenced to enrich the currently limited genomic resources on fungicolous fungi. Specifically, the genomes of Cladobotryum mycophilum ATHUM 6906, Cladobotryum sp. ATHUM 6904, C. tenue CBS 152.92, C. rubrobrunnescens CBS 176.92, Trichoderma aggressivum ATHUM 10375, and Zarea fungicola CBS 507.81A were sequenced. Comparative genomic analysis revealed that the Greek isolate Cladobotryum sp. ATHUM 6904 represents a new, previously unclassified species of the genus. The analysis also highlighted the diversity and plasticity of secondary metabolism at the genomic level. Distribution patterns of secondary metabolism-related genes in the Hypocreaceae family, alongside network analysis, indicate a continuous process of loss and gain of biosynthetic gene clusters (BGCs), as well as horizontal gene transfer events (Christinaki et al. 2024).d. In vitro interaction study between Cladobotryum species and Pleurotus pulmonariusAn in vitro assay was conducted to assess the interaction of five Cladobotryum strains against the edible host P. pulmonarius. Interactions were evaluated both macroscopically through morphological observations of co-cultures, and chemically through analysis of the metabolite extracts of the fungus-fungus interaction zone. The results demonstrated the critical role of secondary metabolites in fungicolous interactions and their adaptive significance in competitive environments.e. In vivo infection experiments on Agaricus bisporus cultivation using six fungicolous fungal speciesIn a climate-controlled experimental chamber, in vivo infection assays were performed on A. bisporus crops, which were grown on commercial substrates, with six fungicolous fungal species (Cladobotryum mycophilum, Cladobotryum dendroides, Cladobotryum varium, Mycogone sp. Zarea fungicola, Trichoderma aggressivum). The findings clearly demonstrated the severity and rapidity with which A. bisporus production can be compromised in the presence of pathogenic fungi. This experimental setup provided the first comparative in vivo observations of all four major fungicolous diseases affecting edible mushrooms and it further established the foundation for linking molecular mechanisms (identified via transcriptomic and metabolomic studies) to visible pathogenic effects.f. Gene expression profiling during host-fungus interactionSamples from the aforementioned infection experiments were used to study gene expression changes (via RT-qPCR) of specific genes potentially involved in the fungicolous lifestyle. The results showed that secondary metabolism plays a pivotal role in driving lifestyle transitions in fungicolous fungi. Furthermore, pyrosequencing revealed that CpG DNA methylation does not appear to regulate genes responsible for the biosynthesis of major secondary metabolites.g. Genomic, transcriptomic, and metabolomic analysis of the fungicolous lifestyle – CSP2024: 509833 ProgramAs part of the exploration of the Hypocreales lifestyle, the research team, under the supervision of Associate Professor Mr. Kouvelis (and supervisor of this thesis), collaborated with the Joint Genome Institute (JGI, USA) within the framework of the international CSP2024 program – Project Code: 509833. A total of 48 DNA and RNA samples were isolated and sent to JGI for sequencing and genome annotation. Additionally, 216 samples were collected from interactions between fungicolous fungi and A. bisporus for transcriptomic and metabolomic analysis. The integration of multi-omics data through the CSP2024 program marks a critical step toward decoding the evolution, specialization, and molecular function of fungicolous fungi within Hypocreales.In summary, morphological and metabolic data revealed that fungicolous species, particularly those in the Cladobotryum genus, possess a rich and highly diverse secondary metabolism. Six new full genomes were sequenced, offering substantial insight into the fungicolous lifestyle. For the first time, all BGCs from four major pathogenic genera of edible mushrooms in the order Hypocreales were mapped at the genomic level. The distribution and network analysis of BGCs across the Hypocreaceae family revealed a dynamic pattern of BGC gain, loss, and horizontal gene transfer. A particularly noteworthy discovery was the confirmation of horizontal transfer of a terpene synthase gene into Cladobotryum mycophilum, likely from a donor within the Agaricales (Basidiomycota), highlighting the genomic-level interplay between host and pathogen. Furthermore, comparative genomics and the analysis of Greek strains contributed to the characterization of a novel Cladobotryum species.In vitro interactions between Cladobotryum and Pleurotus revealed a marked metabolic response by the fungal antagonists, supporting the hypothesis of a “chemical warfare” and reinforcing the role of secondary metabolism as a central mechanism in fungal antagonism.In vivo infections on A. bisporus confirmed the diversity of pathogenic strategies employed by fungicolous fungi. Notably, gene expression profiling during the interaction between C. mycophilum and A. bisporus revealed that secondary metabolism is essential for lifestyle switching and successful colonization of new ecological niches. Two representative examples include (a) the gene of NAPAA synthetase of ε-poly-L-lysine, expressed significantly more, during the saprotrophic stage to provide a competitive advantage against other microbes, and (b) the NI synthetase and T3PKS genes, whose expression is upregulated in the early stages of fungicolous infection.This doctoral dissertation contributes significantly to the understanding of secondary metabolism in fungicolous fungi of the order Hypocreales.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στη μελέτη και την διαλεύκανση των γενετικών και μεταβολικών μηχανισμών που σχετίζονται με την μυκητοφιλία και τον μικροβιακό ανταγωνισμό, με έμφαση στον δευτερογενή μεταβολισμό μυκητόφιλων μυκήτων της τάξης Hypocreales. Οι μύκητες της τάξης Hypocreales παρουσιάζουν μια πληθώρα αλληλεπιδράσεων με ποικίλους οργανισμούς. Μία ομάδα ειδών της οικογένειας Hypocreaceae, αναπτύσσουν μυκητόφιλες αλληλεπιδράσεις με βασιδιομύκητες αποικίζοντας τόσο αυτοφυή όσο και καλλιεργούμενα μανιτάρια, προκαλώντας, επομένως, σημαντικές ζημιές στην παραγωγή των εδώδιμων και φαρμακευτικών ειδών. Οι ασθένειες που προκαλούνται από τους μυκητόφιλους μύκητες α) Cladobotryum spp., β) Mycogone spp., γ) Trichoderma spp., και δ) Zarea spp. επηρεάζουν σοβαρά την απόδοση και την ποιότητα των καλλιεργειών εδώδιμων μανιταριών. Η γνώση των γενετικών μηχανισμών, που ενεργοποιούνται κατά την αλληλεπίδραση μύκητα-μύκητα, είναι απαραίτητη για τη βελτίωση της αποδοτικότητας των καλλιεργειών μανιταριών, μέσω φιλικών προς το περιβάλλον μεθόδων. Τα μυκητόφιλα είδη χαρακτηρίζονται από πλούσιο δευτερογενή μεταβολισμό, που σχετίζεται έντονα με τον τρόπο ζωής τους. Οι μηχανισμοί αλληλεπίδρασης μεταξύ μυκητόφιλων ειδών και των μανιταριών-ξενιστών τους, καθώς και το «οπλοστάσιο» δευτερογενών μεταβολιτών που επιστρατεύεται σε αυτές τις ανταγωνιστικές σχέσεις, παραμένουν σε μεγάλο βαθμό αχαρτογράφητοι. Η διατριβή αυτή επιδιώκει να καλύψει αυτό το κενό, εστιάζοντας στη συγκριτική μελέτη του μυκητόφιλου τρόπου ζωής. Η διατριβή δομήθηκε στις παρακάτω κύριες ερευνητικές ενότητες: α. Συλλογή μυκητόφιλων στελεχών και μοριακή ταυτοποίηση τους Απομονώθηκαν 24 στελέχη μυκητόφιλων μυκήτων από δείγματα μολυσμένων βασιδιοκαρπίων των Agaricus bisporus και Pleurotus spp. ή των υποστρωμάτων και των υλικών επικάλυψης τους. Τα στελέχη ταυτοποιήθηκαν σε επίπεδο είδους με χρήση της περιοχής ITS1–5.8S–ITS2 της πυρηνικής ριβοσωμικής επανάληψης και του γονιδίου rpb2 που κωδικοποιεί την δεύτερη μεγαλύτερη υπομονάδα της RNA πολυμεράσης ΙΙ. Τα στελέχη αυτά αποτέλεσαν σημαντικό υλικό για την μελέτη του μυκητόφιλου τρόπου ζωής. β. Μελέτη ελληνικών στελεχών του γένους Cladobotryum Στην παρούσα διατριβή περιλαμβάνονται τα μοριακά δεδομένα μελέτης 32 Ελληνικών στελεχών του γένους Cladobotryum της Μυκητοθήκης ATHUM, τα οποία αποτελούν μέρος μίας πολυφασικής προσέγγισης η οποία περιλαμβάνει μορφολογικά, μοριακά και χημειοταξονομικά δεδομένα. Τα μορφολογικά πειράματα πραγματοποιήθηκαν από το εργαστήριο ταξινομικής μυκήτων της Επικ. Καθ. Ζ. Γκόνου-Ζάγκου, τα χημειοταξονομικά από τον Υποψήφιο Διδάκτορα Nikola Milic στο εργαστήριο του Αναπλ. Καθ. Νικολάου Φωκιαλάκη (Τμήμα Φαρμακευτικής), ενώ η μοριακή ανάλυση έγινε στα πλαίσια αυτής της διατριβής. Η παρούσα μελέτη ανέδειξε τον ποικιλόμορφο και πλούσιο δευτερογενή μεταβολισμό του γένους Cladobotryum (Milic et al. 2022). γ. Ενδοεργαστηριακή (In house) αλληλούχηση ολόκληρου του γονιδιώματος έξι μυκητόφιλων ειδών και συγκριτική γονιδιωματική ανάλυση. Συνολικά αλληλουχήθηκαν έξι νέα γονιδιώματα, προκειμένου να εμπλουτιστεί η περιορισμένη υπάρχουσα γονιδιωματική πληροφορία. Συγκεκριμένα αλληλουχήθηκαν τα Cladobotryum mycophilum ATHUM 6906, Cladobotryum sp. ATHUM 6904, C. tenue CBS 152.92, C. rubrobrunnescens CBS 176.92, Trichoderma aggressivum ATHUM 10375 και Zarea fungícola CBS 507.81Α. Η συγκριτική γονιδιωματική ανάλυση υπέδειξε ότι το Ελληνικό στέλεχος Cladobotryum sp. ATHUM 6904 αποτελεί ένα, μέχρι τώρα αταξινόμητο, νέο είδος του γένους. Ακόμα ανέδειξε την ποικιλομορφία και την πλαστικότητα του δευτερογενούς μεταβολισμού των μυκητόφιλων ειδών ακόμα και σε γονιδιωματικό επίπεδο. Η κατανομή των γονιδίων του δευτερογενούς μεταβολισμού στην οικογένεια Hypocreaceae και η ανάλυση δικτύου υποδεικνύουν την ύπαρξη μίας διαρκούς διαδικασίας απώλειας & σχηματισμού νέων συρρυθμιζόμενων βιοσυνθετικών γονιδιακών ομάδων (Biosynthetic Gene Clusters – BGC), και οριζόντιας μεταφοράς γονιδίων (Christinaki et al. 2024). δ. Μελέτη αλληλεπίδρασης ειδών του γένους Cladobotryum με το είδος Pleurotus pulmonarius in vitroΕπιπλέον, αξιολογήθηκε in vitro η ανάπτυξη πέντε στελεχών του γένους Cladobotryum απέναντι στο εδώδιμο είδος Pleurotus pulmonarius, το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως ξενιστής. Οι αλληλεπιδράσεις παρατηρήθηκαν τόσο μακροσκοπικά, με την μορφολογική παρατήρηση των καλλιεργειών, όσο και χημικά, με την μελέτη των εκχυλισμάτων αλληλεπίδρασης. Τα αποτελέσματα ανέδειξαν τον κρίσιμο ρόλο των δευτερογενών μεταβολιτών στις μυκητόφιλες αλληλεπιδράσεις και την προσαρμοστική σημασία τους σε συνθήκες ανταγωνισμού. ε. In vivo επιμολύνσεις καλλιεργειών του είδους A. bisporus με έξι μυκητόφιλα είδη μυκήτων. Στο δωμάτιο ελεγχόμενων συνθηκών θερμοκρασίας και υγρασίας, πραγματοποιήθηκαν πειράματα in vivo επιμόλυνσης καλλιεργειών A. bisporus με έξι μυκητόφιλα είδη (Cladobotryum mycophilum, Cladobotryum dendroides, Cladobotryum varium, Mycogone sp. Zarea fungicola, Trichoderma aggressivum). Τα αποτελέσματα έδειξαν με σαφήνεια τη σοβαρότητα και την ταχύτητα με την οποία μπορεί να υποβαθμιστεί η παραγωγή του A. bisporus υπό την παρουσία παθογόνων μυκήτων. Αυτή η πειραματική διάταξη παρείχε τις πρώτες συγκριτικές παρατηρήσεις in vivo και για τις τέσσερις ασθένειες των εδώδιμων μανιταριών και έθεσε τη βάση για την επακόλουθη συσχέτιση μοριακών μηχανισμών (όπως θα προκύψουν από την μεταγραφωματική και την μεταβολωμική μελέτη) με τα μορφολογικά δεδομένα προσβολής. στ. Μελέτη της γονιδιακής έκφρασης κατά την αλληλεπίδραση μύκητα ξενιστή. Από τις παραπάνω επιμολύνσεις συλλέχθηκαν δείγματα και μελετήθηκαν ως προς την τροποποίηση της γονιδιακής έκφρασης (πειράματα RT-qPCR) συγκεκριμένων γονιδίων που πιθανά εμπλέκονται στον μυκητόφιλο τρόπο ζωής. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο δευτερογενής μεταβολισμός παίζει καθοριστικό ρόλο στην αλλαγή του τρόπου ζωής των μυκητόφιλων μυκήτων. Επιπλέον, μέσω πυροαλληλούχησης διαπιστώθηκε ότι η μεθυλίωση του DNA σε περιοχές CpG δεν συμμετέχει στη ρύθμιση των γονιδίων που είναι υπεύθυνα για την παραγωγή των πιο γνωστών δευτερογενών μεταβολιτών. ζ. Γονιδιωματική, Μεταγραφωματική και Μεταβολωμική μελέτη του μυκητόφιλου τρόπου ζωής - Πρόγραμμα CSP2024: 509833Στο πλαίσιο της μελέτης του τρόπου ζωής των μυκήτων της τάξης Hypocreales, η ερευνητική ομάδα, υπό την επίβλεψη του Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Κουβέλη (και επιβλέποντα της παρούσας διατριβής), συνεργάστηκε με το ερευνητικό ίδρυμα Joint Genome Institute (JGI) των Ηνωμένων Πολιτειών Αμερικής, στο πλαίσιο του διεθνούς προγράμματος CSP2024 – Project Code: 509833. Στο πλαίσιο αυτής της συνεργασίας, απομονώθηκαν και αποστάλθηκαν στο JGI 48 δείγματα DNA και RNA, με στόχο την αλληλούχηση και την ορθή επισήμανση των αντίστοιχων γονιδιωμάτων. Ακόμα συλλέχθηκαν 216 δείγματα από τις αλληλεπιδράσεις των μυκητόφιλων μυκήτων με το είδος A. bisporus, όπως περιγράφονται παραπάνω. Αυτά τα δείγματα θα υποβληθούν σε μεταγραφωματική και μεταβολωμική ανάλυση. Η ενσωμάτωση των πολυ-ωμικών δεδομένων μέσω του προγράμματος CSP2024 αποτελεί ένα σημαντικό βήμα για την αποκωδικοποίηση της εξέλιξης, εξειδίκευσης και μοριακής λειτουργίας των μυκητόφιλων μυκήτων της τάξης Hypocreales. Επιγραμματικά, τα μορφολογικά, γενετικά, γονιδιωματικά και μεταβολικά δεδομένα υπέδειξαν ότι τα μυκητόφιλα είδη, και ιδιαίτερα το γένος Cladobotryum, διαθέτουν έναν πλούσιο και ποικιλόμορφο δευτερογενή μεταβολισμό. Αλληλουχήθηκαν έξι νέα πλήρη γονιδιώματα, προσφέροντας σημαντικές γνώσεις για τον μυκητόφιλο τρόπο ζωής. Για πρώτη φορά, χαρτογραφήθηκαν σε επίπεδο γονιδιώματος όλα τα BGCs σε είδη από τέσσερα παθογόνα γένη εδώδιμων μανιταριών, που ανήκουν στην τάξη Hypocreales. Η κατανομή των BGCs στην οικογένεια Hypocreaceae και η ανάλυση δικτύου υποδεικνύουν μια συνεχή διαδικασία απώλειας αρχέγονων και σχηματισμού νέων BGCs, καθώς και γεγονότα οριζόντιας μεταφοράς γονιδίων. Ιδιαίτερης σημασίας εύρημα αποτελεί η απόδειξη της οριζόντιας μεταφοράς ενός γονιδίου συνθάσης τερπενίου στο C. mycophilum, με δότη που ανήκει στην τάξη Agaricales, γεγονός που αναδεικνύει τη δυναμική αλληλεπίδραση μεταξύ μύκητα και ξενιστή ακόμη και σε γονιδιωματικό επίπεδο. Επιπλέον, η συγκριτική γονιδιωματική ανάλυση και η μελέτη ελληνικών στελεχών συνέβαλαν στον χαρακτηρισμό ενός νέου είδους του γένους Cladobotryum. Οι in vitro αλληλεπιδράσεις μεταξύ Cladobotryum και Pleurotus και η μελέτη των εκχυλισμάτων από τη ζώνη αλληλεπίδρασης αποκάλυψαν έντονη μεταβολική απόκριση των ανταγωνιστών. Αποδεικνύεται η ύπαρξη μεταβολικού «πολέμου» και ενισχύεται η υπόθεση ότι ο δευτερογενής μεταβολισμός αποτελεί βασικό μηχανισμό ανταγωνισμού στους μυκητόφιλους μύκητες. Οι in vivo επιμολύνσεις καλλιεργειών του είδους A. bisporus με έξι μυκητόφιλα είδη επιβεβαίωσαν την ποικιλομορφία των στρατηγικών παθογένειας. Ειδικότερα, μελετώντας την έκφραση συγκεκριμένων BGC συνθασών κατά την αλληλεπίδραση του είδους C. mycophilum με A. bisporus, αναδείχθηκε ότι ο δευτερογενής μεταβολισμός διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην αλλαγή τρόπου ζωής και στην εποίκηση νέων ενδιαιτημάτων. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αποτελούν (α) το γονίδιο της συνθετάση NAPAA της ε-πολύ-L-λυσίνης, η οποία ενεργοποιείται στο σαπροτροφικό στάδιο του οργανισμού προσφέροντας ανταγωνιστικό πλεονέκτημα έναντι άλλων μικροοργανισμών του περιβάλλοντος, και (β) τα γονίδια των NI- συνθετάση και T3PKS, των οποίων η έκφραση αυξάνεται χαρακτηριστικά στα αρχικά στάδια του μυκητόφιλου τρόπου ζωής (επιμόλυνση του A. bisporus). Η παρούσα διδακτορική μελέτη συμβάλλει ουσιαστικά στην κατανόηση του δευτερογενούς μεταβολισμού των μυκητόφιλων μυκήτων της τάξης Hypocreales.