Ανάπτυξη βιοκαταλυτικών συστημάτων για την εφαρμογή τους σε διεργασίες παραγωγής βιοντίζελ δεύτερης γενιάς

Abstract

The increasing need to reduce the environmental impact associated with the production of first-generation biodiesel, primarily due to the use of edible oilseeds, has led to significant reforms in European energy policy. In this context, the European Parliament approved the revision of the Renewable Energy Directive (RED II), setting a target for the gradual phase-out of first-generation biofuels by 2030. At the same time, it was mandated that at least 14% of transport fuels must be derived from second-generation biofuels, which are produced from non-edible raw materials such as agricultural, forestry, industrial, and municipal waste. In contrast to conventional homogeneous alkaline transesterification of fats and oils, the biocatalytic approach to advanced biodiesel production using lipases and cutinases offers significant advantages, especially when waste and by-products from the biodiesel industry are used as feedstocks. Enzymatic transesterification is more efficient, more environmentally friendly, less energy-intensive, and considerably simplifies the downstream recovery and purification of the resulting biodiesel. The main objective of this doctoral thesis is the development of biocatalytic systems and processes for the production of second generation biodiesel, specifically fatty acid methyl esters (FAMEs), from lipid feedstocks rich in free fatty acids (FFAs). Specifically, the study focuses on the utilization of an acid oil, a by-product of alkaline transesterification, with a high FFA content (~40%). Due to its strong tendency to undergo saponification under alkaline conditions, this by-product cannot be reused through conventional biodiesel production techniques and is usually discarded as waste. This work proposes an innovative solution for the valorization of this by-product via enzymatic transesterification using hydrolytic enzymes, entirely avoiding soap formation. In doing so, a non-utilizable industrial stream is converted into a valuable end product, contributing to the circular economy and the sustainability of second-generation biofuel production. In line with the principles of circular economy and sustainable biotransformation, the enzymes were evaluated both in their free and immobilized forms, aiming to improve catalytic stability, reusability, and scalability toward semi-industrial applications. Immobilization techniques included both physical adsorption and covalent binding, using a variety of supports of both natural and commercial origin. The results of this thesis are structured into three distinct chapters:1. Commercial lipases and enzymatic transesterification: The first part of the study evaluated the catalytic performance of commercial lipases, with emphasis on Rhizopus oryzae lipase (Biolipasa-R), in the context of developing a sustainable enzymatic transesterification process for the valorization of low-quality oils. Biolipasa-R was immobilized on both natural supports such as diatomaceous earth (yield up to 60%) and commercial supports such as methacrylate resins (yield up to 100%). The immobilized enzyme exhibited enhanced catalytic activity toward feedstocks with high FFA content, outperforming the commercial lipase Novozym® 435, achieving FAME conversion rates of 95.1% compared to 35%, respectively. These findings highlight Biolipasa-R as an efficient and cost-effective biocatalyst for biodiesel production, promoting the use of industrial by-products and environmentally friendly immobilization technologies.2. Combined use of hydrolytic enzymes: This part investigates a synergistic enzymatic system comprising Biolipasa-R of Rhizopus oryzae lipase (ROL) and Fusarium oxysporum cutinase (FOC), targeting the efficient conversion of acidic oil into FAMEs without the formation of unwanted by-products. Initially, single-variable optimization reactions were conducted to determine key parameters (temperature, enzyme ratio, pH, methanol amount), followed by analysis of variants (ANOVA) analysis and experimental design using Design Expert® 13.0 software. The optimal conditions were: temperature 31.8°C, ROL/FOC ratio of 3.9:1, methanol/oil molar ratio of 2.6:1, and no pH adjustment. FOC was successfully immobilized on all tested supports, with the best reusability observed for the enzyme immobilized on macroporous divinylbenzene (only 4% activity loss after three cycles). The dual-enzyme system was successfully scaled up 50-fold without loss of efficiency, confirming its potential for larger-scale applications.3. Production and application of LIP2 lipase: The third part focused on the downstream optimization of LIP2 lipase production from the yeast Yarrowia lipolytica (Y. lipolytica), aiming to use it in biodiesel synthesis. Various nutrient media were evaluated, with YPG identified as the most suitable for enzyme expression. Regarding concentration and storage, precipitation with 40% ammonium sulfate ((NH₄)₂SO₄) and simple centrifugation (depending on culture scale) were found to be the most effective methods, while storage at –20°C ensured enzyme stability. Immobilization of LIP2 on octadecyl methacrylate achieved yields of up to 81%, and FAME conversion in transesterification reactions reached 76%, making this formulation highly promising for biodiesel applications. Overall, this doctoral thesis highlights the potential of enzymatic biocatalysis for the valorization of non-edible, low-quality lipid feedstocks in second-generation biodiesel production. The use of efficient and economically viable biocatalysts, combined with environmentally friendly immobilization techniques and the successful exploitation of industrial by-products, reinforces the feasibility of integrating such processes into sustainable, circular bioenergy production models. The results of this work are expected to contribute to the optimization of innovative biocatalytic approaches and lay the groundwork for future semi-industrial and industrial-scale implementation.

Η αυξανόμενη ανάγκη για μείωση των περιβαλλοντικών επιπτώσεων που συνδέονται με την παραγωγή βιοντίζελ πρώτης γενιάς, κυρίως λόγω της χρήσης εδώδιμων ελαιούχων σπόρων, έχει οδηγήσει σε σημαντικές μεταρρυθμίσεις στην Ευρωπαϊκή ενεργειακή πολιτική. Στο πλαίσιο αυτό, το Ευρωπαϊκό Κοινοβούλιο ενέκρινε την αναθεώρηση της Οδηγίας για τις Ανανεώσιμες Πηγές Ενέργειας (RED II), θέτοντας ως στόχο τη σταδιακή απόσυρση των βιοκαυσίμων πρώτης γενιάς έως το 2030. Παράλληλα, ορίστηκε ότι τουλάχιστον το 14% των καυσίμων που χρησιμοποιούνται στις μεταφορές θα πρέπει να προέρχεται από βιοκαύσιμα δεύτερης γενιάς, τα οποία παράγονται από μη εδώδιμες πρώτες ύλες, όπως γεωργικά, δασικά, βιομηχανικά και αστικά απόβλητα. Σε αντίθεση με τη συμβατική, ομοιογενή αλκαλική μετεστεροποίηση λιπών και ελαίων, η βιοκαταλυτική προσέγγιση για την παραγωγή προηγμένου βιοντίζελ με χρήση λιπασών και κουτινασών παρουσιάζει σημαντικά πλεονεκτήματα, ιδίως όταν χρησιμοποιούνται ως πρώτη ύλη απόβλητα και παραπροϊόντα της βιομηχανίας βιοντίζελ. Η ενζυμική μετεστεροποίηση είναι αποδοτικότερη, φιλικότερη προς το περιβάλλον, λιγότερο ενεργοβόρα, ενώ διευκολύνει σημαντικά τις διαδικασίες ανάκτησης και καθαρισμού του παραγόμενου βιοντίζελ. Κεντρικός στόχος της παρούσας διατριβής είναι η ανάπτυξη βιοκαταλυτικών συστημάτων και διεργασιών για την παραγωγή βιοντίζελ δεύτερης γενιάς, δηλαδή μεθυλεστέρων λιπαρών οξέων (Fatty Acid Methyl Esters, FAMEs), από λιπαρές πρώτες ύλες υψηλής περιεκτικότητας σε ελεύθερα λιπαρά οξέα (Free Fatty Acids, FFAs). Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιείται ένα όξινο λάδι, παραπροϊόν τις αλκαλικής μετεστεροποίησης, με υψηλή περιεκτικότητα σε FFAs (~40%), το οποίο εξαιτίας της τάσης του να οδηγεί σε σαπωνοποίηση κατά την αλκαλική επεξεργασία δεν μπορεί να επαναξιοποιηθεί με τις συμβατικές τεχνικές παραγωγής βιοντίζελ, και καταλήγει ως απόβλητο. Η παρούσα μελέτη προτείνει μια καινοτόμο λύση για την αξιοποίηση αυτού του παραπροϊόντος, μέσω μετεστεροποίησης με χρήση υδρολυτικών ενζύμων, αποφεύγοντας πλήρως τη σαπωνοποίηση. Με αυτόν τον τρόπο, ένα μη αξιοποιήσιμο παραπροϊόν μετατρέπεται σε χρήσιμο τελικό προϊόν, συνεισφέροντας στην κυκλική οικονομία και στη βιωσιμότητα της παραγωγής βιοκαυσίμων δεύτερης γενιάς. Στο πλαίσιο των αρχών της κυκλικής οικονομίας και της βιώσιμης βιομετατροπής, τα ένζυμα αξιολογήθηκαν όχι μόνο σε ελεύθερη αλλά και σε ακινητοποιημένη μορφή, προκειμένου να αυξηθεί η σταθερότητα, η επαναχρησιμοποίηση και η δυνατότητα εφαρμογής τους σε ημιβιομηχανική κλίμακα. Οι τεχνικές ακινητοποίησης που εφαρμόστηκαν περιλαμβάνουν τόσο τη φυσική προσρόφηση όσο και την ομοιοπολική δέσμευση με την χρήση τόσο φυσικών όσο και εμπορικών φορέων. Η ενότητα των αποτελεσμάτων της παρούσας διατριβής διαρθρώνεται σε τρία επιμέρους κεφάλαια: 1. Εμπορικές λιπάσες και ενζυμική μετεστεροποίηση: Στο πρώτο μέρος της μελέτης αξιολογήθηκε η καταλυτική απόδοση εμπορικών λιπασών, με έμφαση στη λιπάση Biolipasa-R, στο πλαίσιο της ανάπτυξης μιας βιώσιμης ενζυμικής διεργασίας μετεστεροποίησης για την αξιοποίηση ελαίων χαμηλής ποιότητας. Η εν λόγω λιπάση ακινητοποιήθηκε τόσο σε φυσικά υποστρώματα όπως η γη διατόμων (απόδοση έως και 60%), όσο και σε εμπορικούς φορείς όπως οι μεθακρυλικές ρητίνες (απόδοση έως και 100%). Η ακινητοποιημένη Biolipasa-R παρουσίασε αυξημένη καταλυτική ενεργότητα έναντι του ελαίου με υψηλή περιεκτικότητα σε FFAs, ξεπερνώντας την εμπορική λιπάση Novozym® 435, με ποσοστά μετατροπής 95.1% και 35% αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα αναδεικνύουν τη Biolipasa-R ως αποδοτικό και οικονομικά βιώσιμο καταλύτη για την παραγωγή βιοντίζελ, προωθώντας τη χρήση βιομηχανικών παραπροϊόντων και περιβαλλοντικά φιλικών τεχνολογιών ακινητοποίησης. 2. Συνδυαστική χρήση υδρολυτικών ενζύμων: Η παρούσα εργασία διερευνά τη χρήση ενός συνδυαστικού ενζυμικού συστήματος που περιλαμβάνει τη λιπάση Biolipasa-R του Rhizopus oryzae (ROL) και την κουτινάση του Fusarium oxysporum (FOC), με στόχο την αποδοτική μετατροπή του παραπροϊόντος σε FAMEs, χωρίς την παρουσία ανεπιθύμητων παραπροϊόντων. Αρχικά πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις σημειακής βελτιστοποίησης για τον καθορισμό βέλτιστων παραμέτρων (θερμοκρασία, λόγος ενζύμων, pH, ποσότητα μεθανόλης), ενώ στη συνέχεια εφαρμόστηκε ανάλυση διασποράς (ANOVA) και σχεδιασμός πειράματος μέσω του λογισμικού Design Expert® 13.0. Οι βέλτιστες συνθήκες αντιστοιχούν σε θερμοκρασία 31.8°C,λόγο ROL/FOC 3.9:1, μοριακή αναλογία μεθανόλης/λαδιού 2.6:1 και χωρίς ρύθμιση του pH. Η FOC ακινητοποιήθηκε επιτυχώς σε όλους τους διαθέσιμους φορείς, με καλύτερη επαναχρησιμοποίηση να παρουσιάζει το ένζυμο που ακινητοποιήθηκε σε φορέας τύπου macroporous divinylbenzene, με μόλις 4% απώλεια ενεργότητας μετά από τρεις κύκλους. Το σύστημα κλιμακώθηκε επιτυχώς 50 φορές, χωρίς απώλεια αποδοτικότητας, επιβεβαιώνοντας την καταλληλότητά του για εφαρμογές σε μεγαλύτερη κλίμακα. 3. Παραγωγή και εφαρμογή της λιπάσης LIP2: Το τρίτο μέρος επικεντρώνεται στη βελτιστοποίηση της κατιούσας διεργασίας παραγωγής της λιπάσης LIP2 του μύκητα Yarrowia lipolytica (Y. lipolytica), με σκοπό τη χρήση της στην παραγωγή βιοντίζελ. Αξιολογήθηκαν διάφορα θρεπτικά μέσα, με το YPG να αναδεικνύεται ως το πλέον κατάλληλο για την παραγωγή του ενζύμου. Όσον αφορά τη συγκέντρωση και αποθήκευση, βρέθηκε ότι η κατακρήμνιση με 40% θειικό αμμώνιο ((NH4)2SO4) και η απλή φυγοκέντρηση (ανάλογα με την κλίμακα της καλλιέργειας) αποτελούν τις βέλτιστες μεθόδους, ενώ η αποθήκευση στους -20°C εξασφαλίζει την σταθερότητα του ενζύμου. Η ακινητοποίηση της LIP2 σε φορέα τύπου octadecyl methacrylate παρουσίασε απόδοση έως και 81%, ενώ σε ενζυμικές αντιδράσεις μετεστεροποίησης το ποσοστό μετατροπής έφτασε το 76%, καθιστώντας το σκεύασμα αυτό ιδιαίτερα υποσχόμενο για εφαρμογές στην παραγωγή βιοντίζελ. Συνολικά, η παρούσα διατριβή αναδεικνύει τη δυναμική της ενζυμικής βιοκατάλυσης στην αξιοποίηση μη εδώδιμων, χαμηλής ποιότητας λιπιδικών πρώτων υλών για την παραγωγή βιοντίζελ δεύτερης γενιάς. Η χρήση αποδοτικών και οικονομικά βιώσιμων βιοκαταλυτών, η εφαρμογή φιλικών προς το περιβάλλον τεχνικών ακινητοποίησης και η επιτυχής αξιοποίηση βιομηχανικών παραπροϊόντων ενισχύουν την προοπτική ένταξης τέτοιων διεργασιών σε βιώσιμα, κυκλικά μοντέλα παραγωγής ενέργειας. Τα ευρήματα της διατριβής ενδείκνυται να συμβάλλουν στη βελτιστοποίηση καινοτόμων βιοκαταλυτικών προσεγγίσεων και θέτουν τις βάσεις για μελλοντική εφαρμογή τους σε ημιβιομηχανική και βιομηχανική κλίμακα.