Biorefinery and bioprocess development using fruit waste for the production of poly(3-hydroxybutyrate) and property evaluation

Abstract

The scope of this PhD thesis is the evaluation of fruit waste as renewable feedstock for the sustainable production of poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) and value-added products within the framework of a biorefinery approach. The extracted free sugars from fruit waste were used as carbon source for the production of PHB by Paraburkholderia sacchari in fed-batch bioreactor fermentations. Different initial sugar concentrations, carbon to inorganic phosphorus (C/IP) ratios, IP addition during feeding and volumetric oxygen transfer coefficients (kLa) were evaluated to optimise PHB production. The highest intracellular PHB accumulation (66.6%), PHB concentration (108.3 g/L), productivity (3.28 g/(Lh)) and yield (0.33 g/g) were achieved at 40 g/L initial sugar concentration, C/IP ratio of 26.5, 202.6 h-1 kLa value and 20% IP supplementation in the feeding solution. The effect of different cell harvesting time on PHB properties showed no influence in the molecular weight and thermal properties. The harvest time influenced the tensile strength that was reduced from 28.7 MPa at 22 h to 13.3 MPa at 36 h. The elongation at break and Young’s Modulus were in the range of 3.6-14.8% and 830-2000 MPa, respectively.Under the viewpoint of exploiting the full potential of fruit waste, a holistic biorefinery was developed for the production of multiple end-products. Free sugars, a phenolic-rich fraction and a pectin-rich fraction were initially extracted from fruit waste. The phenolic-rich fraction contained a total phenolic content of 780 mg gallic acid equivalents (GAE) per 100 g fruit waste (on a dry basis), exhibiting antioxidant activity (I= 81.97%). Catechol, protocatechuic and salicylic acids were identified as the main phenolic compounds. For pectin extraction, different organic acids were initially evaluated (e.g. citric acid, hydrochloric acid, nitric acid). The optimal pectin extraction was achieved using citric acid treatment of sugar- and phenolic-free solids followed by pectin precipitation with ethanol resulting in a pectin extraction yield of 20.3% with 71% galacturonic acid (GalA) content, 51.7% degree of esterification (DE) and 959.6 g/mol equivalent of weight (EW). The remaining solids were subjected to hydrothermal treatment leading to 69% overall glucan to glucose conversion yield and 20.9% overall hemicellulose to C5/C6 sugars conversion yield via enzymatic hydrolysis. The hydrolysate was employed as fermentation medium in bioreactor cultures of P. sacchari, while the sugar-rich extract was employed as feeding solution during the feeding stage of the fed-batch fermentation, resulting in 72.4 g/L PHB concentration with 2.2 g/(Lh) productivity. This biorefinery concept may produce 39.2 g phenolic-rich extract, 46.8 g pectin-rich extract, and 196.5 g PHB from 1 kg fruit waste.To further extend the sustainability of the proposed biorefinery concept, the downstream separation and purification of PHB has been developed via combined crude enzyme bacterial cell lysis followed by solvent extraction and circular utilisation of bacterial lysate as nutrient supplement for PHB production. Enzymatic lysis of P. sacchari cells was initially evaluated using crude enzymes produced via solid state fermentation of Aspergillus oryzae. The optimum protease activity (156 U per g cell dry weight) resulted in 66.9% lysis of residual cell weight. PHB purification with 1,3-dioxolane, dimethyl carbonate, anisole, ammonium laurate and chloroform was evaluated at different processing parameters (extraction duration, temperature) using wet and dry bacterial cells, as well as, enzymatically lysed wet bacterial cells. The highest recovery yield (94.5%) and purity (98.1%) were obtained with 1,3-dioxolane at 80°C and 6 h processing time using enzymatically disrupted bacterial cells. The bacterial cell lysate was used as nutrient supplement for circular PHB production in fed-batch P. sacchari bioreactor cultures leading to the production of 78.7 gPHB/L, 56.9% (w/w) PHB content and 2.3 g/(Lh) productivity. Low Global Warming Potential (1.3 kg CO2-eq/kgPHB) and Abiotic Depletion Potential (14.4 MJ/kgPHB) were estimated for PHB purification via enzymatic cell lysis and PHB purification with 1,3-dioxolane demonstrating the development of a sustainable and circular process for PHB production. This PhD thesis finally focused on the preparation of PHB-based blends with ethyl cellulose (EC) and lignin (L) by the solvent casting technique and the evaluation of the properties of the resulting biocomposites. Lignin was extracted from winery waste streams via different pretreatment methods, including treatment with NaOH and deep eutectic solvents (DES). Different ratios of lignin to PHB were chosen to evaluate the potential development of a homogeneous dispersion in the film matrix. The lignin percentage addition of 2%, 6% and 8% (w/w) were employed in PHB-based composite production using lignin particles derived via NaOH treatment. In the case of composite production using PHB, EC and L extracted with DES, the ratios of 80:20 (PHB:EC), 78:20:2 (PHB:EC:L-DES) and 74:20:6 (PHB:EC:L-DES) were used. The dispersion of lignins in PHB alone or in combination with EC was achieved following an oil-in-water pickering emulsion approach. The effect of the additives used on the crystallinity, microstructure, thermal and mechanical properties of the PHB matrix was investigated in detail. The properties of the blends were examined by differential scanning calorimetry, thermogravimetry and mechanical tests. The morphology was examined using a confocal microscopy and roughness parameters were determined by optical profilometry.

Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η αξιολόγηση των αποβλήτων φρούτων από λαϊκές αγορές ως ανανεώσιμη πρώτη ύλη για τη παραγωγή πολυ(3-υδροξυβουτυρικού) εστέρα (PHB) και προϊόντων προστιθέμενης αξίας στo πλαίσιo ανάπτυξης ενός καινοτόμου και βιώσιμου βιοδιυλιστηρίου. Τα ελεύθερα σάκχαρα χρησιμοποιήθηκαν ως μοναδική πηγή άνθρακα για την παραγωγή PHB μέσω ημισυνεχών ζυμώσεων σε βιοαντιδραστήρα με χρήση του βακτηριακού στελέχους Paraburkholderia sacchari DSM 11765. Αρχικά, αξιολογήθηκαν διαφορετικοί παράμετροι, όπως αρχική συγκέντρωση σακχάρων, λόγος άνθρακα προς φώσφορο (C/IP), προσθήκη ανόργανου φωσφόρου κατά τη διάρκεια της τροφοδοσίας στη διεργασία ημιδιαλείποντος έργου, και ογκομετρικός συντελεστής μεταφοράς οξυγόνου (kLa), με στόχο τη βελτιστοποίηση της παραγωγής του PHB. Οι μέγιστες τιμές ενδοκυτταρικής συσσώρευσης PHB (66,6% κβ.), τελικής συγκέντρωσης PHB (108,3 g/L), παραγωγικότητας (3,28 g/(Lh)) και απόδοσης μετατροπής σακχάρων σε PHB (0,33 g/g) επιτεύχθηκαν με αρχική συγκέντρωση σακχάρων ίση με 40 g/L, με λόγο C/IP ίσο με 26,5, με τιμή kLa ίση με 202,6 h⁻¹ και προσθήκης 20% ανόργανου φωσφόρου στο διάλυμα τροφοδοσίας. Η διάρκειας της ζύμωσης δεν επηρέασε τόσο το μοριακό βάρος όσο και τις θερμικές ιδιότητες του PHB. Ωστόσο, η διάρκεια της ζύμωσης επηρέασε την αντοχή σε εφελκυσμό, η οποία μειώθηκε από 28,7 MPa στις 22 h σε 13,3 MPa στις 36 h ζύμωσης. Η ολκιμότητα και το μέτρο ελαστικότητας Young κυμάνθηκαν από 3,6 έως 14,8% και από 830 έως 2000 MPa, αντίστοιχα.Η διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε επίσης στην ανάπτυξη ενός πρότυπου βιοδιυλιστηρίου προκειμένου να αξιοποιηθούν όλα τα συστατικά των αποβλήτων φρούτων από λαϊκές αγορές. Στο βιοδιυλιστήριο αυτό αρχικά διαχωρίστηκαν τα ελεύθερα σάκχαρα, ένα πλούσιο σε φαινολικά εκχύλισμα και ένα ακατέργαστο εκχύλισμα πλούσιο σε πηκτίνη. Το κλάσμα πλούσιο σε φαινολικά συστατικά περιείχε συνολική περιεκτικότητα σε φαινολικά ίση με 780 mg γραμμοϊσοδύναμα γαλλικού οξέος (GAE) ανά 100 g ξηρής μάζας. Η αντιοξειδωτική ικανότητα του κλάσματος αυτού ήταν σημαντική (I=81,97%). Οι κύριες φαινολικές ενώσεις που ανιχνεύθηκαν ήταν η κατεχόλη, το πρωτοκατεχοϊκό οξύ και το σαλικυλικό οξύ. Η εκχύλιση κλάσματος πλούσιου σε πηκτίνες από τα απόβλητα των φρούτων διερευνήθηκε με χρήση διαφορετικών οξέων (π.χ. κιτρικό οξύ, υδροχλωρικό οξύ, νιτρικό οξύ). Η βέλτιστη μέθοδος εκχύλισης πηκτίνης επιτεύχθηκε μέσω επεξεργασίας των στερεών, απαλλαγμένων από ελεύθερα σάκχαρα και φαινολικές ενώσεις, με χρήση κιτρικού οξέος και επακόλουθη καθίζηση της πηκτίνης με αιθανόλη. Η μέγιστη απόδοση εκχύλισης της πηκτίνης ήταν ίση με 20,3%, η περιεκτικότητα γαλακτουρονικού οξέος ήταν ίση με 71%, ο βαθμός εστεροποίησης ήταν ίσος με 51,7% και το ισοδύναμο μοριακό βάρος ήταν ίσο με 959,6 g/mol. Εν συνεχεία, το εναπομείναν στερεό υπόλειμμα υποβλήθηκε σε υδροθερμική επεξεργασία και ενζυμική υδρόλυση των πολυσακχαριτών. Επιτεύχθηκε συνολική απόδοση μετατροπής της γλυκάνης σε γλυκόζη ίση με 69% και της ημικυτταρίνης σε σάκχαρα ίση με 20,9%. Το υδρόλυμα πλούσιο σε σάκχαρα αξιοποιήθηκε ως θρεπτικό μέσο ζύμωσης για την ανάπτυξη του μικροοργανισμού P. sacchari σε βιοαντιδραστήρα, ενώ το εκχύλισμα πλούσιο σε ελεύθερα σάκχαρα που παρήχθη από τα απόβλητα φρούτων χρησιμοποιήθηκε ως μέσο τροφοδοσίας κατά τη διάρκεια της ζύμωσης ημι-διαλείποντος έργου. Η ζύμωση αυτή είχε ως αποτέλεσμα την παραγωγή 72,4 g/L PHB με παραγωγικότητα ίση με 2,2 g/(L·h). Τέλος, το προτεινόμενο βιοδιυλιστήριο είχε ως αποτέλεσμα την παραγωγή 39,2 g εκχυλίσματος πλούσιου σε φαινολικά, 46,8 g εκχυλίσματος ακατέργαστης πηκτίνης, και 196,5 g PHB από 1 kg αποβλήτων φρούτων. Για την περαιτέρω ενίσχυση της βιωσιμότητας του προτεινόμενου βιοδιυλιστήριου, αναπτύχθηκε μια ολοκληρωμένη διεργασία για τον διαχωρισμό και τον καθαρισμό του PHB, η οποία συνδυάζει την ενζυμική λύση των βακτηριακών κυττάρων με χρήση ακατέργαστων ενζύμων με την εκχύλιση του PHB με χρήση πράσινων διαλυτών. Η περιβαλλοντική βιωσιμότητα της διεργασίας ενισχύθηκε μέσω της κυκλικής αξιοποίησης του υδρολύματος που παρήχθη από τα διερρηγμένα βακτηριακά κυττάρα ως θρεπτικό υπόστρωμα για την εκ νέου παραγωγή PHB μέσω ζύμωσης. Μελετήθηκε η ενζυμική λύση των κυττάρων του P. sacchari με χρήση ακατέργαστων ένζυμων που παρήχθησαν μέσω ζύμωσης στερεής κατάστασης που πραγματοποιήθηκε με τον μύκητα Aspergillus oryzae. Η μέγιστη λύση της κυτταρικής μάζας ελεύθερης PHB (66.9%) επιτεύχθηκε με χρήση πρωτεολυτικής ενεργότητας ίσης με 156 U ανά γραμμάριο ξηρής κυτταρικής μάζας. Διερευνήθηκε επίσης η ανάκτηση του PHB με χρήση διαφόρων διαλυτών (1,3-διοξολάνη, ανθρακικός διμεθυλεστέρας, ανισόλη, λαυρικό αμμώνιο και χλωροφόρμιο) υπό διαφορετικές συνθήκες επεξεργασίας (διάρκεια εκχύλισης, θερμοκρασία) και διαφορετικές μορφές κυτταρικής μάζας (υγρή, ξηρή και ενζυμικά διαρρηγμένα κύτταρα σε υγρή κατάσταση). Η βέλτιστη απόδοση ανάκτησης του PHB (94,5%) και η βέλτιστη καθαρότητα του βιοπολυμερούς (98,1%) επιτεύχθηκαν με χρήση 1,3-διοξολάνης στους 80°C και διάρκεια επεξεργασίας ίσης με 6 ώρες, όταν χρησιμοποιήθηκαν ενζυμικά διερρηγμένα κύτταρα σε υγρή κατάσταση. Το υδρόλυμα που παρήχθη από τα διερρηγμένα βακτηριακά κύτταρα αξιοποιήθηκε περαιτέρω ως θρεπτικό συμπλήρωμα σε ημισυνεχή καλλιέργεια του P. sacchari, οδηγώντας σε παραγωγή 78,7 g/L PHB, 56,9% (w/w) περιεκτικότητα σε PHB και παραγωγικότητα ίση με 2,3 g/(L·h). Η εφαρμογή της συγκεκριμένης μεθόδου διαχωρισμού και ανάκτησης του PHB κατέδειξε χαμηλές τιμές ως προς το δυναμικό υπερθέρμανσης του πλανήτη (1,3 kg CO₂-eq/kg PHB) και ως προς το δυναμικό εξάντλησης των αβιοτικών πόρων (14,4 MJ/kg PHB). Με αυτό τον τρόπο τεκμηριώνεται η δυνατότητα ανάπτυξης μίας περιβαλλοντικά βιώσιμης παραγωγής PHB.Η παρούσα διδακτορική διατριβή ολοκληρώθηκε με την παρασκευή βιοσύνθετων υλικών με χρήση PHB, αιθυλοκυτταρίνης (EC) και λιγνίνης (L), στα οποία μελετήθηκαν οι φυσικοχημικές και μηχανικές ιδιότητες. Η λιγνίνη απομονώθηκε από στερεά απόβλητα οινοποίησης (συγκεκριμένα βόστρυχους) μέσω διαφορετικών μεθόδων διαχωρισμού, όπως αλκαλική επεξεργασία με υδροξείδιο του νατρίου και χρήση βαθέως εύτηκτων διαλυτών (DES). Η λιγνίνη προερχόμενη από την επεξεργασία με NaOH χρησιμοποιήθηκε σε διαφορετικά ποσοστά 2%, 6% και 8% (w/w) για την παραγωγή βιοσύνθετων υλικών με βάση το PHB. Στην περίπτωση παραγωγής βιοσύνθετων υλικών με χρήση PHB, EC και L που εκχυλίστηκε με DES, χρησιμοποιήθηκαν οι αναλογίες 80:20 (PHB:EC), 78:20:2 (PHB:EC:L-DES) και 74:20:6 (PHB:EC:L-DES). Η ομοιόμορφη διασπορά των σωματιδίων λιγνίνης είτε στην μήτρα από PHB είτε όταν χρησιμοποιήθηκαν PHB και αιθυλοκυτταρίνη πραγματοποιήθηκε μέσω τεχνικής pickering γαλακτώματος τύπου ελαίου σε νερό. Η επίδραση των πρόσθετων στις ιδιότητες των μειγμάτων, καθώς και οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ της κρυσταλλικότητας, της μικροδομής, των θερμικών και μηχανικών ιδιοτήτων διερευνήθηκαν εκτενώς. Οι ιδιότητες των βιοσύνθετων υλικών προσδιορίστηκαν μέσω διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης, θερμοσταθμικής ανάλυσης και μηχανικών δοκιμών. Η μορφολογία των υλικών μελετήθηκε με συνεστιακή μικροσκοπία, ενώ τα ποιοτικά χαρακτηριστικά της επιφανειακής τραχύτητας καθορίστηκαν μέσω οπτικής προφιλομετρίας.