Investigating the feasibility of spectroscopic techniques and non-invasive sampling of biofluids to explore physiological alterations during physical exercise

Abstract

This PhD thesis presents the development and application of an innovative, non-invasive analytical framework for monitoring physiological and metabolic responses to physical exercise, utilizing saliva and dried blood spot (DBS) sampling. The study drew upon a substantial cohort of 260 athletes representing a broad spectrum of sporting disciplines, encompassing both individual and team sports. Participants included competitive runners and triathlon athletes, football, basketball, volleyball and tennis players, boxers, karatekas, and muai thai athletes, as long as aerial hoops and aerobic gymnastics athletes and pole dancers, ensuring a wide representation of physiological demands and training regimens. Crucial to the success of this effort was the close collaboration with numerous sports clubs and athletic associations across the region of Epirus, Greece. Ongoing communication with coaches, trainers, and administrative staff facilitated participant recruitment, ensured adherence to protocol requirements, and strengthened the practical relevance of the study. This regional network of support not only provided access to a varied and committed participant base but also helped bridge the gap between laboratory research and applied sports science in real-world training environments. The work is structured into four distinct yet interconnected phases, integrating analytical techniques —spectroscopic (ATR-FTIR, Vis photometry, and NMR) and chemometric (multivariate and statistical analyses)— to evaluate biochemical changes with precision and minimal invasiveness. This integrative approach addresses the increasing demand for real-time, field-deployable diagnostic tools in sports science, health monitoring, and personalized fitness assessment. In Phase 1, attenuated total reflectance Fourier-transform infrared (ATR-FTIR) spectroscopy was applied to saliva samples from both low-level (occasional light load training) and high-level athletes (frequent heavy load training) to evaluate its potential as a non-invasive tool for physiological monitoring. The primary aim was to explore the feasibility of using salivary biochemical profiles as indicators of training status and physical conditioning. For the first time, multivariate statistical analysis of the salivary infrared data revealed clear biochemical distinctions between athletic levels, underlining the effectiveness of ATR-FTIR in capturing exercise-induced metabolic alterations. These findings highlighted the responsiveness of salivary composition to training load and demonstrated the diagnostic value of saliva in capturing cumulative physiological adaptations. Phase 1 established the proof-of-concept that infrared saliva fingerprinting can serve as a rapid, field-applicable screening method, laying the analytical and conceptual foundation for more dynamic, intensity-resolved investigations in the subsequent Phases. Phase 2 advanced this line of inquiry by focusing on the dynamics of salivary composition during physical exercise of increasing intensity (0, 5, 10, and 15 km/h) by employing ATR-FTIR spectroscopy and advanced multivariate analysis. The novelty lies in the integration of second-derivative spectral preprocessing with extensive chemometric modeling—specifically PCA-LDA and PLS-DA—to enable fine-tuned, non-invasive classification of training loads based on salivary biochemical profiles. The innovation is expanded on the construction and rigorous validation of predictive models that achieved high classification accuracy, demonstrating the discriminative power of salivary infrared fingerprints. In addition, alterations in salivary lactate and glucose were compared with the corresponding trends in blood, resulting an excellent harmonization in the case of lactate, in contrast to glucose, facts that align with the literature. Multivariate analysis revealed 5 spectral features (corresponding to phosphate, phospholipids, glucose, lactate, thiocyanate) where they lead to discrimination. To our surprise, thiocyanate (SCN⁻) emerged as a prominent spectral feature linked with physical exercise. Phase 2 highlighted the value of spectroscopic fingerprinting in identifying metabolite-specific signatures of physical stress (such as the candidate SCN⁻) and in supporting personalized training strategies. To quantitatively validate the role of thiocyanate as a biomarker, Phase 3 introduced a robust, cost-effective photometric method tailored for high-throughput analysis of salivary SCN⁻ concentrations. A large-scale study involving 161 athletes confirmed, for the first time, a consistent decrease in thiocyanate levels with escalating exercise intensity. Detailed statistical evaluation, also revealed statistically significant influences of gender and smoking status on salivary thiocyanate profiles, thereby enriching our understanding of interindividual variability in metabolic responses to physical stress. This comprehensive dataset enabled precise mapping of SCN⁻ response trends across diverse athlete profiles and training intensities. The findings represent the first large-cohort validation of thiocyanate’s utility as a non-invasive, exercise-responsive biomarker, supporting its future use in personalized monitoring frameworks within sports and exercise science. In Phase 4, the research turned to systemic metabolic profiling using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy applied to dried blood spot (DBS) samples. This approach leveraged the minimally invasive nature of blood microsampling—achieved through DBS cards and alternative sorbent materials—making it particularly suitable for athletic monitoring in field conditions. Despite the inherent challenges of limited sample volume and matrix complexity, NMR successfully distinguished metabolic signatures associated with increasing exercise intensities. This represents a novel integration of microsampling and high-resolution spectroscopy in sports science, where such a combination remains largely unexplored. The findings not only underscored the impact of training load on systemic metabolism but also demonstrated the feasibility of DBS-NMR workflows for real-world biomonitoring. Moreover, this Phase highlights the complementarity of different biofluids and analytical platforms in constructing a holistic, minimally invasive physiological monitoring system. Taken together, this thesis delivers a multidimensional, minimally invasive analytical strategy for assessing biochemical and metabolic responses to physical exercise. The work underscores the synergistic utility of ATR-FTIR spectroscopy, photometric quantification of thiocyanate, and NMR metabolomics in personalizing athletic training, enhancing performance monitoring, and potentially informing broader health diagnostics. The methodologies and findings presented herein contribute significantly to the growing field of non-invasive/minimally-invasive biomonitoring and pave the way for future translational applications in sports science.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή αναπτύσσει και εφαρμόζει ένα καινοτόμο, μη επεμβατικό αναλυτικό πλαίσιο για την παρακολούθηση φυσιολογικών και μεταβολικών αποκρίσεων κατά τη διάρκεια της σωματικής άσκησης, αξιοποιώντας τη σίελο και δείγματα ξηρού αίματος (DBS). Η μελέτη βασίστηκε σε ένα αντιπροσωπευτικό δείγμα 260 αθλητών, οι οποίοι προέρχονταν από ένα ευρύ φάσμα αθλητικών κλάδων, περιλαμβάνοντας ατομικά (τρέξιμο, τρίαθλο, τένις, πυγμαχία, muay thai, καράτε, pole dancing, aerial hoops (στεφάνη), αερόβιες αθλοπαιδιές) και ομαδικά αθλήματα (ποδόσφαιρο, μπάσκετ, βόλεϊ). Καθοριστική υπήρξε η συνεργασία με αθλητικούς συλλόγους και προπονητικά κέντρα της ευρύτερης περιοχής της Ηπείρου, μέσω της οποίας διευκολύνθηκε η πρόσβαση στο συμμετοχικό δυναμικό και διασφαλίστηκε η εφαρμογή του ερευνητικού πρωτοκόλλου σε ρεαλιστικά περιβάλλοντα άσκησης. Η δικτύωση αυτή συνέβαλε ουσιαστικά στη γεφύρωση του χάσματος μεταξύ εργαστηριακής έρευνας και εφαρμοσμένης αθλητικής επιστήμης. Η μελέτη οργανώνεται σε τέσσερις αλληλοσυμπληρούμενες φάσεις, στις οποίες ενσωματώνονται αναλυτικές τεχνικές —φασματοσκοπικές (ATR-FTIR, φωτομετρία ορατού και NMR) και χημειομετρικά εργαλεία (πολυπαραμετρική και στατιστική ανάλυση)— με στόχο την ακριβή και αξιόπιστη αποτύπωση βιοχημικών μεταβολών με ελάχιστα επεμβατικό τρόπο. Το πλαίσιο αυτό ανταποκρίνεται στις σύγχρονες ανάγκες για επιτόπια και προσωποποιημένη παρακολούθηση της φυσικής κατάστασης στον χώρο της επιστήμης της άθλησης. Στην Πρώτη Φάση, εφαρμόστηκε φασματοσκοπία υπερύθρου μετασχηματισμού Fourier με αποσβένουσα ολική ανάκλαση (ATR-FTIR) σε δείγματα σιέλου από αθλητές διαφορετικού επιπέδου (χαμηλού επιπέδου αθλητές που ασκούνται περιστασιακά και ήπια και υψηλού επιπέδου αθλητές που εκτελούν συχνές προπονήσεις υψηλής έντασης). Στόχο είχε την αξιολόγηση της σιέλου ως εναλλακτικού, μη-επεμβατικού δείγματος για την παρακολούθηση της σωματικής/αθλητικής δραστηριότητας. Για πρώτη φορά, η πολυπαραμετρική ανάλυση των υπέρυθρων φασμάτων της σιέλου ανέδειξε σαφείς διαφορές μεταξύ υψηλού και χαμηλού επιπέδου αθλητών. Η παρούσα Φάση ανέδειξε τη χρήση του υπέρυθρου αποτυπώματος της σιέλου—ως γρήγορη, φορητή και πρακτική μέθοδος αξιολόγησης—δημιουργώντας την αναλυτική βάση για επερχόμενες μελέτες σχετικά με την έντασης της άσκησης που αναπτύχθηκαν στις επόμενες Φάσεις. Η Δεύτερη Φάση εστίασε στην μεταβολή της σύστασης της σιέλου κατά την αύξηση της έντασης της άσκησης (0, 5, 10, 15 km/h) αξιοποιώντας φασματοσκοπία υπερύθρου (ATR-FTIR) και προηγμένες τεχνικές πολυπαραμετρικής ανάλυσης. Η καινοτομία έγκειται στον συνδυασμό φασματοσκοπίας δεύτερης παραγώγου με χημειομετρικά μοντέλα—PCA-LDA και PLS-DA—για την διάκριση του προπονητικού φορτίου μέσω της πολυπαραμετρικής ανάλυσης του φασματικού προφίλ της σιέλου Η καινοτομία επεκτείνεται και στην κατασκευή και αυστηρή επικύρωση των προβλεπτικών μοντέλων, τα οποία παρουσίασαν υψηλή ακρίβεια ταξινόμησης, αποδεικνύοντας τη διακριτική ικανότητα του υπέρυθρου φασματικού αποτυπώματος της σιέλου. Επιπλέον, οι μεταβολές του γαλακτικού οξέος και της γλυκόζης στην σίελο συγκρίθηκαν με τις αντίστοιχες τάσεις που παρουσιάζουν στο αίμα, δίνοντας εξαιρετική ταύτιση στην περίπτωση του γαλακτικού, σε αντίθεση με την γλυκόζη, γεγονότα που εναρμονίζονται με την βιβλιογραφία. Η πολυπαραμετρική ανάλυση ανέδειξε 5 φασματικές μεταβλητές (που αντιστοιχούν στα φωσφορικά ιόντα, φωσφολιπίδια, γλυκόζη, γαλακτικό, θειοκυανικά ιόντα) στις οποίες οφείλεται η διάκριση. Προς έκπληξή μας, το θειοκυανικό ιόν (SCN⁻) αναδείχθηκε ως σημαντικός μεταβολίτης συσχετισμένος με την σωματική άσκηση. Η Φάση 2 επισήμανε τη σημασία της φασματοσκοπικής παρακολούθησης της σιέλου στην ανάδειξη χαρακτηριστικών μεταβολιτών που συνδέονται με τη σωματική άσκηση (όπως την περίπτωση των θειοκυανικών ιόντων), υποστηρίζοντας παράλληλα την ανάπτυξη εξατομικευμένων στρατηγικών προπόνησης. Η Τρίτη Φάση εξέτασε τον ρόλο του θειοκυανικού ιόντος ως έναν δυνητικό βιοδείκτη μέσω της ανάπτυξης και επικύρωσης μιας αξιόπιστης, φωτομετρικής μεθόδου ποσοτικού προσδιορισμού των SCN⁻ στην σίελο. Σε δείγμα 161 αθλητών παρατηρήθηκε, για πρώτη φορά στην βιβλιογραφία, σταθερή μείωση των επιπέδων SCN⁻ με την αύξηση της έντασης άσκησης. Η ενδελεχής στατιστική ανάλυση κατάγραψε επίσης στατιστικά σημαντικές διαφοροποιήσεις ανά φύλο και συνήθειες καπνίσματος. Η Φάση αυτή αποτελεί την πρώτη ολοκληρωμένη έρευνα μεγάλης κλίμακας της συμπεριφοράς των SCN⁻ σχετιζόμενη με τον αθλητισμό. Τα εξαιρετικά ευρήματα αναδεικνύουν τα θειοκυανικά ιόντα ως ένα δυνητικό μη-επεμβατικό βιοδείκτη στην παρακολούθηση—σε πραγματικό χρόνο—της φυσιολογικής απόκρισης στην άσκηση, ενισχύοντας τη δυνατότητα εφαρμογής του σε εξατομικευμένα συστήματα προπονητικής αξιολόγησης. Στη Τέταρτη Φάση, η έρευνα επικεντρώθηκε στη αποτύπωση μεταβολικών αλλαγών μέσω φασματοσκοπίας πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR), εφαρμοσμένης σε δείγματα ξηρής κηλίδας αίματος (DBS). Η προσέγγιση αυτή αξιοποίησε τον ελάχιστα επεμβατικό χαρακτήρα της μικροδειγματοληψίας αίματος—μέσω καρτών DBS και εναλλακτικών προσροφητικών υλικών—καθιστώντας την ιδιαίτερα κατάλληλη για παρακολούθηση αθλητών σε συνθήκες πεδίου. Παρά τις προκλήσεις που σχετίζονται με τον περιορισμένο όγκο δείγματος και την πολυπλοκότητα του υποστρώματος, η φασματοσκοπία NMR κατάφερε να προσδιορίσει πλήθος χαρακτηριστικών μεταβολιτών, και να διακρίνει μεταβολικά προφίλ που σχετίζονται με την αύξηση της έντασης της άσκησης. Η Φάση αυτή εισάγει με επιτυχία μια καινοτόμο συνδυαστική εφαρμογή μικροδειγματοληψίας αίματος και φασματοσκοπίας υψηλής ευαισθησίας στον τομέα του αθλητισμού, όπου η εν λόγω προσέγγιση παραμένει ως επί το πλείστων ανεξερεύνητη. Επιπλέον, η Φάση αναδεικνύει τη συμπληρωματικότητα μεταξύ διαφορετικών βιολογικών υγρών και αναλυτικών μεθοδολογιών για την ανάπτυξη ενός ολιστικού και ελάχιστα επεμβατικού συστήματος φυσιολογικής παρακολούθησης. Συνολικά, η διατριβή αυτή προτείνει μια πολυδιάστατη και μη-επεμβατική/ελάχιστα επεμβατική στρατηγική παρακολούθησης των φυσιολογικών και μεταβολικών αποκρίσεων κατά την άσκηση. Προτείνει το θειοκυανικό ως νέο βιοδείκτη έντασης άσκησης και συνδυάζει τεχνικές ATR-FTIR, φωτομετρίας ορατού και NMR για την παροχή ενός ολοκληρωμένου εργαλείου προσωποποιημένης αξιολόγησης φυσικής κατάστασης, με ευρύτατες εφαρμογές στην επιστήμη της άθλησης.