Development of molecular-based assays for the detection and quantification of viruses in wastewater samples

Abstract

The present thesis investigates the development and analytical validation of highly sensitive and specific molecular-based methods, as well as their application for the early detection of a broad spectrum of viruses in urban wastewater, considering the importance of wastewater- based epidemiology (WBE) as a community-level, non-invasive tool for monitoring the spread of viral infections. The initial objective was to assess inhibition effects associated with the complex wastewater matrix and evaluate various enhancing strategies to mitigate the impact of inhibitory substances on downstream analysis. Subsequently, robust reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) assays were developed to quantify viral loads and assess the seasonality of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2 (SARS-CoV-2), Respiratory Syncytial Virus (RSV) and Influenza A (IAV) and B (IBV) viruses, investigating possible shifts in seasonal patterns related to the emergence of the COVID-19 pandemic. To address the limitations of qPCR associated with inhibition effects and the inability to perform absolute quantification, the performance of the advanced droplet digital PCR (ddPCR), was evaluated. A 4-plex RT-ddPCR assay was developed and validated, demonstrating superior performance compared to qPCR assays. This assay was then applied over an extended surveillance period and successfully detected the epidemic waves of the targeted respiratory viruses. The viral detection panel was subsequently expanded with the development of a highly sensitive and specific 9-plex RT-ddPCR assay capable of detecting SARS-CoV-2, Hepatitis A (HAV), and Hepatitis E (HEV), in addition to the previously targeted respiratory viruses. This assay was successfully applied both at the citywide level and in the confined environment of a passenger ship, demonstrating its utility for real-time surveillance of these epidemiologically important viral targets. These findings demonstrate the potential of WBE and highlight the necessity of developing and employing molecular- based assays for its support.

Η παρούσα διατριβή διερευνά την ανάπτυξη και αναλυτική επικύρωση ευαίσθητων και ειδικών μοριακών μεθόδων, καθώς και την εφαρμογή τους για την έγκαιρη ανίχνευση ευρέος φάσματος ιών σε αστικά λύματα, λαμβάνοντας υπόψη τη σημασία της επιδημιολογίας λυμάτων ως μη επεμβατικού εργαλείου παρακολούθησης της εξάπλωσης ιικών λοιμώξεων. Ο αρχικός στόχος ήταν η εκτίμηση των αναστολέων που υπάρχουν στην πολύπλοκη μήτρα των λυμάτων και η αξιολόγηση μηχανισμών για τον περιορισμό της επίδρασης τους στις μοριακές τεχνικές. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκαν μεθοδολογίες ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR) για την ποσοτικοποίηση και την αξιολόγηση της εποχικότητας του κορονοϊού, του αναπνευστικού συγκυτιακού ιού και των ιών γρίπης Α και Β, διερευνώντας πιθανές μεταβολές στην εποχικότητά τους, λόγω της πανδημίας COVID-19. Για την αντιμετώπιση των περιορισμών της qPCR (αναστολή, αδυναμία απόλυτης ποσοτικοποίησης) αξιολογήθηκε η απόδοση της προηγμένης ψηφιακής τεχνολογίας PCR μέσω σταγονιδίων (droplet digital PCR, ddPCR). Αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μία μεθοδολογία τετραπλής RT-ddPCR , η οποία επέδειξε ανώτερη απόδοση σε σύγκριση με τις qPCR μεθόδους. Η αναπτυχθείσα RT- ddPCR μεθοδολογία ανίχνευσε επιτυχώς τους αναπνευστικούς ιούς σε μια εκτεταμένη περίοδο επιτήρησης. Ακολούθως, το πάνελ ανίχνευσης επεκτάθηκε με την ανάπτυξη μιας εξαιρετικά ευαίσθητης και ειδικής εννεαπλής RT-ddPCR μεθόδου, ικανή για την ταυτόχρονη ανίχνευση και ποσοτικοποίηση του κορονοϊού και των ιών ηπατίτιδας Α και Ε, πέραν των ήδη στοχευόμενων αναπνευστικών ιών. Η μέθοδος εφαρμόστηκε επιτυχώς σε δείγματα λυμάτων για την επιτήρησή των ιών αυτών σε πραγματικό χρόνο, τόσο σε επίπεδο κοινότητας όσο και στο περιορισμένο περιβάλλον ενός επιβατικού πλοίου. Τα ευρήματα αυτά καταδεικνύουν τη δυναμική της επιδημιολογίας λυμάτων και την αναγκαιότητα ανάπτυξης και χρήσης μοριακών τεχνικών για την υποστήριξή της.