Μελέτη του ρόλου της πρωτεϊνης RANKL στον καρκίνο του μαστού και στην οστική μετάσταση σε διαγονιδιακά ποντίκια

Abstract

RANKL, a cytokine belonging to the TNF superfamily, is known for its crucial role in osteoclast maturation and bone remodeling. Its activity has been linked to diseases associated with increased bone resorption, such as osteoporosis, and it has also been shown to influence mammary gland morphogenesis. Furthermore, its dysregulated expression is associated with breast cancer and bone metastasis. TgRANKL transgenic mice that overexpress the human RANKL protein (huRANKL) exhibit characteristics of pronounced osteoporosis as well as increased density in the mammary gland, allowing the study of RANKL-induced pathogenic mechanisms and the preclinical evaluation of drugs. Within the scope of this doctoral thesis, aiming to elucidate the role of RANKL in mammary cancer and bone metastasis, in vitro experiments were conducted to study the effect of RANKL on the viability of EO771 mammary cancer cells and on the expression of selected genes related to carcinogenesis and calcium signaling. Additionally, proteins with dysregulated expression or phosphorylation in EO771 cells upon RANKL stimulation were detected via proteomic analysis, to identify biological processes and pathways directly affected by RANKL. The effect of conditioned media derived from cells of the bone microenvironment on EO771 cell viability was also examined. Finally, in vivo EO771-induced mammary cancer and bone metastasis models were developed to study the impact of huRANKL overexpression on mammary carcinogenesis or mammary cancer-derived bone metastasis. In preclinical settings, we evaluated the efficacy of denosumab, a monoclonal antibody against huRANKL, in mammary cancer and bone metastasis models, as well as of the bisphosphonate zoledronic acid in bone metastasis. The overall approach of these experiments aims to clarify the role of RANKL in the development of mammary tumors and bone metastasis, as well as to preclinically evaluate its inhibitors for the treatment of breast cancer and bone metastases. The results of the in vitro experiments showed that RANKL significantly enhanced the viability of EO771 cancer cells and the expression of genes related to breast cancer, such as Stat5 and Ccnd1, as well as genes involved in calcium regulation that have been associated with the promotion of oncogenesis. The proteomic data demonstrated that RANKL stimulation leads to notable alterations in the protein landscape associated with cancer cell metabolism. In particular, there was an upregulation of proteins involved in mitochondrial function, organization, and lipid biosynthesis, alongside a decrease in the expression of proteins linked to oxidative phosphorylation. Phosphoproteomic analysis further indicated that RANKL primarily disrupts signaling pathways and biological processes related to chromatin structure and regulation, mRNA surveillance and processing, as well as the cell cycle. Additionally, it was observed that factors secreted by osteoclasts or bone marrow adipocytes, when present in the culture medium, enhanced the viability of EO771 cells. In vivo mammary cancer development via orthotopic transplantation of EO771 cells revealed that TgRANKL mice exhibited earlier onset of tumor formation as well as increased tumor burden compared to WT mice. Moreover, prophylactic administration of denosumab in TgRANKL mice delayed tumor development, indicating that early inhibition of RANKL/RANK signaling may have preventive benefits in breast cancer. However, therapeutic administration of denosumab after tumor formation failed to show beneficial results. Finally, the effect of huRANKL overexpression was examined in experimental models of bone metastasis via systemic injection of EO771 cells. Based on these findings, TgRANKL mice exhibited earlier onset and a higher burden of mammary cancer-derived bone metastasis, along with significant osteolysis of the cortical bone. Prophylactic administration of denosumab reduced both the frequency and progression of bone metastasis, offering protection against osteolysis, while therapeutic use of denosumab was effective mainly in limiting bone loss. Similarly, in the TgRANKL bone metastasis model, the bisphosphonate zoledronic acid was administered in both prophylactic and therapeutic regimens, producing comparable results to denosumab. These outcomes highlight the value of anti-osteoporotic treatments in preventing bone metastases. In summary, the results of this thesis demonstrate that activation of the RANKL/RANK signaling pathway amplifies the tumorigenic potential of EO771 cells by upregulating genes and proteins associated with carcinogenesis. Additionally, overexpression of huRANKL in vivo seems to drive both the progression of breast cancer and the formation of bone metastasis, highlighting the importance of the RANKL/RANK pathway as a therapeutic target for patients with breast cancer or bone metastases, particularly in a preventive context.

Η κυτταροκίνη RANKL, μέλος της υπεροικογένειας TNF, είναι γνωστή για τον καθοριστικό της ρόλο στην ωρίμανση των οστεοκλαστών και την οστική αναδιαμόρφωση. Η δράση της έχει συνδεθεί με παθήσεις που σχετίζονται με αυξημένη οστική απορρόφηση, όπως η οστεοπόρωση, ενώ έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζει και τη μορφογένεση του μαστικού αδένα. Επιπλέον, η απορρυθμισμένη έκφρασή της συνδέεται με τον καρκίνο του μαστού και την οστική μετάσταση. Τα TgRANKL διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν την ανθρώπινη πρωτεΐνη RANKL (huRANKL), εμφανίζουν χαρακτηριστικά έντονης οστεοπόρωσης αλλά και αυξημένη πυκνότητα στον μαστικό αδένα, επιτρέποντας την μελέτη των RANKL-επαγόμενων μηχανισμών παθογένεσης και την αξιολόγηση φαρμάκων σε προκλινικό επίπεδο. Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής, ήταν η διαλεύκανση του ρόλου του RANKL στον καρκίνο του μαστού και στην οστική μετάσταση. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήθηκαν in vitro πειράματα για τη μελέτη της επίδρασης του RANKL στη βιωσιμότητα των ΕΟ771 κυττάρων καρκίνου του μαστού και στην έκφραση επιλεγμένων γονιδίων που σχετίζονται με την καρκινογένεση και τη σηματοδότηση ασβεστίου. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε πρωτεομική ανάλυση για την ανίχνευση πρωτεϊνών με απορρυθμισμένη έκφραση ή φωσφορυλίωση μετά από διέγερση των ΕΟ771 κυττάρων με RANKL, με σκοπό την αναγνώριση των βιολογικών διεργασιών και μονοπατιών που επηρεάζονται άμεσα από τον RANKL. Ακόμη, εξετάστηκε η επίδραση υπερκείμενων καλλιέργειας κυττάρων του οστικού μικροπεριβάλλοντος στη βιωσιμότητα των ΕΟ771 κυττάρων. Τέλος, αναπτύχθηκαν in vivo μοντέλα καρκίνου του μαστού και οστικής μετάστασης μέσω έγχυσης κυττάρων ΕΟ771, ώστε να μελετηθεί η επίδραση της υπερέκφρασης του huRANKL τόσο στη μαστική καρκινογένεση όσο και στη δημιουργία οστικών μεταστάσεων που προκαλούνται από τον καρκίνο του μαστού. Σε προκλινικές δοκιμές αξιολογήθηκε η δράση του μονοκλωνικού αντισώματος denosumab, έναντι του huRANKL, στο μοντέλο του καρκίνου του μαστού και στην οστική μετάσταση αλλά και του διφωσφονικού zoledronic acid στην οστική μετάσταση. Η συνολική προσέγγιση αυτών των πειραμάτων αποσκοπεί στην αποσαφήνιση του ρόλου του RANKL στην ανάπτυξη μαστικών όγκων και οστικής μετάστασης, αλλά και στην προκλινική αξιολόγηση αναστολέων του για την αντιμετώπισή του καρκίνου του μαστού και των οστικών μεταστάσεων. Τα αποτελέσματα των in vitro πειραμάτων έδειξαν ότι ο RANKL ενίσχυσε σημαντικά τη βιωσιμότητα των ΕΟ771 κυττάρων καθώς και την έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με τον καρκίνο του μαστού όπως Stat5 και Ccnd1 και γονιδίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση του ασβεστίου και έχουν συσχετιστεί βιβλιογραφικά με την ογκογένεση. Για την περαιτέρω αποσαφήνιση της επίδρασης του RANKL στα ΕΟ771 κύτταρα πραγματοποιήθηκε πρωτεομική και φωσφο-πρωτεομική ανάλυση σε κύτταρα που καλλιεργήθηκαν απουσία ή παρουσία RANKL. Τα αποτελέσματα της πρωτεομικής ανάλυσης έδειξαν ότι η διέγερση των ΕO771 κυττάρων με RANKL επιφέρει σημαντικές αλλαγές στο πρωτεϊνικό προφίλ που σχετίζονται με τον μεταβολισμό των καρκινικών κυττάρων. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη μιτοχονδριακή λειτουργία και οργάνωση αλλά και με βιοσυνθετικές διεργασίες λιπιδίων, ενώ παράλληλα μειώθηκε η έκφραση πρωτεϊνών που σχετίζονται με την οξειδωτική φωσφορυλίωση. Όσον αφορά την φωσφο-πρωτεομική ανάλυση αποδείχθηκε ότι η διέγερση των ΕΟ771 κυττάρων με RANKL απορρυθμίζει κυρίως σηματοδοτικά μονοπάτια και βιολογικές διεργασίες που σχετίζονται με την οργάνωση και ρύθμιση της χρωματίνης, την επιτήρηση και επεξεργασία του mRNA και τον κυτταρικό κύκλο. Επιπλέον, αποδείχθηκε ότι τα υπερκείμενα των καλλιεργειών οστεοκλαστών ή λιποκυττάρων του μυελού των οστών, αύξησαν τη βιωσιμότητα των κυττάρων ΕΟ771. Στα in vivo πειράματα επαγωγής καρκίνου του μαστού μέσω ορθοτοπικής μεταφοράς κυττάρων EO771, παρατηρήθηκε ότι στα TgRANKL ποντίκια η εμφάνιση των μαστικών όγκων ήταν ταχύτερη και η εξέλιξή τους δριμύτερη σε σύγκριση με τα ποντίκια αγρίου τύπου (WT). Επιπλέον, η προφυλακτική χορήγηση του μονοκλωνικού αντισώματος denosumab σε TgRANKL ποντίκια καθυστέρησε την ανάπτυξη των όγκων, υποδεικνύοντας ότι η έγκαιρη αναστολή της σηματοδότησης RANKL/RANK μπορεί να έχει προληπτικό όφελος στον καρκίνο του μαστού. Ωστόσο, η θεραπευτική χορήγηση denosumab μετά τον σχηματισμό των όγκων δεν έδειξε αποτελεσματικότητα. Τέλος, εξετάστηκε η επίδραση της υπερέκφρασης του huRANKL σε πειραματικά μοντέλα οστικής μετάστασης μέσω συστηματικής έγχυσης των ΕΟ771 κυττάρων. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης ανάλυσης, παρατηρήθηκε ότι στα TgRANKL ποντίκια προάγεται η οστική μετάσταση, με ταχύτερη εμφάνιση και αυξημένο μεταστατικό φορτίο, ενώ παράλληλα προκαλείται εκτεταμένη οστεόλυση του φλοιώδους οστού. Η προφυλακτική χορήγηση του denosumab μείωσε την εμφάνιση και την εξέλιξη της οστικής μετάστασης, προστατεύοντας τα οστά από την οστεόλυση, ενώ η θεραπευτική χρήση του είχε ευεργετικά αποτελέσματα μόνο στον περιορισμό της οστικής απώλειας. Παράλληλα, στο TgRANKL μοντέλο οστικής μετάστασης χορηγήθηκε το διφωσφονικό zoledronic acid σε προφυλακτικό και θεραπευτικό σχήμα, παρουσιάζοντας παρόμοια αποτελέσματα με το denosumab, υποδεικνύοντας τη χρησιμότητα των αντι-οστεοπορωτικών θεραπειών στην πρόληψη οστικής μετάστασης. Συνοψίζοντας, τα ευρήματα της παρούσας διατριβής καταδεικνύουν ότι η ενεργοποίηση της σηματοδότησης RANKL/RANK ενισχύει τις προκαρκινικές ιδιότητες των κυττάρων EO771, οδηγώντας σε αυξημένη έκφραση γονιδίων και πρωτεϊνών που σχετίζονται με την καρκινογένεση. Επιπλέον, η υπερέκφραση του huRANKL in vivo φαίνεται να προάγει την ανάπτυξη καρκίνου του μαστού και την οστική μετάσταση, αναδεικνύοντας τη σημασία της οδού RANKL/RANK ως θεραπευτικού στόχου για ασθενείς με καρκίνο του μαστού ή οστικές μεταστάσεις, ιδιαίτερα σε προληπτικό πλαίσιο.