Investigation of microbial degradation of postharvest fungicides applied in fruit processing industry in bioreactor systems

Abstract

This Ph.D. thesis investigated the microbial degradation of postharvest fungicides applied in the fruit processing industry in bioreactor systems. The research focused on the biodegradation of the most used postharvest fungicides, namely fludioxonil, imazalil and ortho-phenylphenol, in various types of bioreactor systems (immobilized cell bioreactors, batch bioreactors, sequencing batch reactors). The effectiveness of bioreactor systems in the removal of the above-mentioned postharvest fungicides was explored using high-performance liquid chromatography analysis and monitoring concurrently their physicochemical and biological traits. The microbial community structure during the degradation of the above-mentioned postharvest fungicides in bioreactor systems was also identified using high-throughput amplicon sequencing to link biosystems performance under various operating conditions with the proliferation of certain microbial groups. Firstly, fludioxonil-rich wastewater (250 mg/L) was treated in an aerobic immobilized cell bioreactor inoculated with activated sludge under the HRT of 10 days (Chapter 4). Fludioxonil was removed in a percentage greater than 95%, noting mineralization of the organic-F moiety of fludioxonil (94.0 ± 5.2%). COD removal efficiencies also overcame 80%. A notable increase in the proportion of Empedobacter, Sphingopyxis and Rhodopseudomonas was recorded throughout the biotreatment process. Moreover, a microaerophilic immobilized cell bioreactor was installed and operated to biotreat fludioxonil-rich wastewater (200 mg/L) under various hydraulic retention times (HRTs) (Chapter 5). In this bioreactor system, fludioxonil removal efficiency exceeded 96%, even at a low HRT of 3.9 days. Twelve (12) metabolites were identified by Quadrupole Time-Of-Flight Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, indicating the hydroxylation, carbonylation, decyanation and deamination of the fludioxonil molecule. An increase in the relative abundances of the genera Pseudomonas, Clostridium and Terrimonas under shortened HRT was noted. The biotreatment of fludioxonil-rich wastewater (200 mg/L) was also examined in a Sequencing Batch Reactor (SBR) operating under intermittent aeration conditions (Chapter 6). Fludioxonil removal was higher than 96%, while COD removal efficiency was near 70%. Illumina sequencing revealed the predominance of Acidovorax and Fimbriimonadaceae spp., whereas nitrification was mainly carried out by members of the genera Nitrosomonas and Nitrospira. Further, a novel fludioxonil-degrading bacterial strain, named FLX-12, was isolated, which was able to effectively reduce high fludioxonil concentrations (even 250 mg/L)(Chapter 7). Phylogenetic analysis placed the bacterial strain FLX-12 in the genus Ochrobactrum. During the performance of Whole Genome Sequencing (WGS) and in vitro substrate utilization tests, it was found that the protocatechuic pathway was encoded by FLX-12. The optimal pH and temperature for the growth of strain FLX-12 were 7 and 37 oC, respectively. During the examination of fludioxonil degradation in aerobic batch bioreactors inoculated with strain FLX-12, high fludioxonil concentration (250 mg/L) was significantly reduced (by 88%) within an incubation period of 5 days. Fludioxonil degradation rate constants were increased in the case of co-metabolism, especially when amino acids L-asparagine, L-histidine, L-isoleucine, and L-proline were added. The ability of strain FLX-12 to effectively biotreat fludioxonil-rich wastewater was further examined in an aerobic immobilized cell bioreactor operated under various HRTs (Chapter 8). The immobilized cell bioreactor bioaugmented with strain FLX-12 resulted in high fludioxonil reduction throughout the whole experimental period, reaching removal efficiencies of 98%, even under an HRT of 1 day, whereas COD removal efficiency was steadily above 84%. In particular, Aridibacter (16.54 ± 3.89%) followed by Rhodococcus (12.05 ± 0.74%) were the most predominant genera under operation of the bioaugmented system at an HRT of 1 day. Furthermore, the bioprocessing of imazalil-rich wastewater (250 mg/L) was examined in an aerobic immobilized cell bioreactor inoculated with activated sludge and operated under an HRT of 10 days (Chapter 9). The immobilized cell bioreactor was capable of reducing imazalil concentration by 95%. After an acclimatization period of 15 days, COD removal efficiencies exceeded 76%, whereas a gradual increase in the electrical conductivity of the effluent was noted as a consequence of imazalil biotreatment. A predominance of bacterial genera Pseudomonas, Ochrobactrum, Stenotrophomonas, Cupriavidus, Rhodopseudomonas, Bordetella and Bellilinea was recorded, indicating thus their important role in the imazalil removal process. Moreover, the biotreatment of fungicide-based wastewater consisting of both imazalil and fludioxonil was performed in a horizontal immobilized cell bioreactor under various hydraulic retention times (Chapter 10). During the biotreatment of this fludioxonil and imazalil-based wastewater, fludioxonil concentration significantly decreased from 100 mg/L to 5.37 ± 0.17 mg/L, corresponding to removal efficiency greater than 94% throughout the entire experimental period. On the other hand, a limited decrease in imazalil concentration was observed, indicating a preference of immobilized microbiota for fludioxonil over imazalil. Pseudomonas and Azospirillum were the predominant bacterial genera throughout the entire experimental period.Lastly, ortho-phenylphenol-containing wastewater (250 mg/L) was also treated in an aerobic immobilized cell bioreactor under various hydraulic retention times (Chapter 11). A remarkable decrease in ortho-phenylphenol concentration from 250 mg/L to 0.09 ± 0.01 mg/L was denoted throughout the whole experimental period, resulting in a removal efficiency of 99.97 ± 0.01%. In addition, COD removal efficiencies greater than 90% were recorded, even under an HRT of 1.6 days. Illumina sequencing showed the predominance of the genera Dokdonella, Terrimonas, Mesorhizobium, Aridibacter, Reyranella, Nitrospira and Sphingopyxis during the biotreatment under the HRT range tested. Ιt is concluded that the examined bioreactor systems operating under various aeration conditions and hydraulic retention times were sufficient to deplete high concentrations of postharvest fungicides. These biological systems constitute a sustainable biological solution for the depuration of fungicide-rich wastewater from the fruit packaging industry.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή διερευνήθηκε σε συστήματα βιοαντιδραστήρων η μικροβιακή αποδόμηση μετασυλλεκτικών μυκητοκτόνων που εφαρμόζονται στις βιομηχανίες μεταποίησης φρούτων. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε επεξεργασία υγρών αποβλήτων που περιείχαν τα μετασυλλεκτικά μυκητοκτόνα fludioxonil, imazalil και ortho-phenylphenol σε διάφορα συστήματα βιοαντιδραστήρων (ακινητοποιημένης βιομάζας, διαλείποντος έργου, διαλείποντος έργου περιοδικής λειτουργίας - SBR). Η αποτελεσματικότητα των συστημάτων ως προς την απομάκρυνση των προαναφερομένων μετασυλλεκτικών μυκητοκτόνων αξιολογήθηκε καθ’ όλη τη διάρκεια της λειτουργίας τους μέσω της χρήσης υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης. Παράλληλα πραγματοποιήθηκε χαρακτηρισμός των μικροβιακών κοινοτήτων με Illumina αλληλούχιση που αναπτύχθηκαν κατά τη διάρκεια της λειτουργίας των βιοαντιδραστήρων αυτών. Ο πρώτος βιοαντιδραστήρας που χρησιμοποιήθηκε ήταν ακινητοποιημένης βιομάζας ανοδικής ροής που τροφοδοτούνταν με υγρό απόβλητο που περιείχε 250 mg/L μετασυλλεκτικού μυκητοκτόνου fludioxonil (Κεφάλαιο 4). Εμβολιάστηκε με ενεργό ιλύ και λειτουργούσε υπό αερόβιες συνθήκες και υδραυλικό χρόνο παραμονής 10 ημερών. Η απομάκρυνση του fludioxonil και του COD ήταν υψηλή, υπερβαίνοντας το 95% και 80%, αντίστοιχα. Παρατηρήθηκε παρουσία ιόντων φθορίου στο επεξεργασμένο υγρό απόβλητο γεγονός που οφειλόταν στην απελευθέρωση του φθορίου (94,0 ± 5,2%) από το μόριο της ένωσης fludioxonil. Κατά τη διάρκεια της λειτουργίας του συστήματος, σημειώθηκε σημαντική αύξηση στην σχετική αφθονία στελεχών των γενών Empedobacter, Sphingopyxis και Rhodopseudomonas. Υγρό απόβλητο που περιείχε 200 mg/L μετασυλλεκτικού μυκητοκτόνου fludioxonil επεξεργάστηκε σε βιοαντιδραστήρα ακινητοποιημένης βιομάζας, ο οποίος λειτουργούσε υπό μικροαερόφιλες συνθήκες και διαφορετικούς υδραυλικούς χρόνους παραμονής (Κεφάλαιο 5). Η απομάκρυνση του fludioxonil ήταν υψηλή (>96%), ακόμα και όταν ο βιοαντιδραστήρας λειτουργούσε υπό χαμηλό υδραυλικό χρόνο παραμονής 3,6 ημερών. Καθ’όλη τη διάρκεια λειτουργίας του βιοαντιδραστήρα, η απομάκρυνση του COD ήταν υψηλότερη του 65%, παρόλο που η απομάκρυνση του COD μειωνόταν όσο μειωνόταν ο υδραυλικός χρόνος παραμονής. Κατά τη διερεύνηση του μεταβολικού μονοπατιού διάσπασης του fludioxonil με Quadrupole Time-Of-Flight Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, ταυτοποιήθηκαν 12 μεταβολίτες, οι οποίοι υποδείκνυαν τη σταδιακή υδροξυλίωση, καρβονυλίωση, αποκυάνωση και απαμίνωση του μορίου του fludioxonil. Κατά τη διερεύνηση της μικροβιακής διαδοχής, όσο μειωνόταν ο υδραυλικός χρόνος παραμονής παρατηρήθηκε αύξηση της σχετικής αφθονίας στελεχών των γενών Pseudomonas, Clostridium και Terrimonas.Επιπλέον, υγρό απόβλητο που περιείχε 200 mg/L μετασυλλεκτικού μυκητοκτόνου fludioxonil επεξεργάστηκε σε βιοαντιδραστήρα SBR, ο οποίος λειτουργούσε υπό διακοπτόμενες συνθήκες αερισμού (Κεφάλαιο 6). Η απομάκρυνση του fludioxonil ήταν υψηλή και υπερέβαινε το 96%, ενώ η απομάκρυνση του COD προσέγγισε σε ποσοστό το 70%. Κατά την ανάλυση των Illumina δεδομένων παρατηρήθηκε αύξηση της σχετικής αφθονίας στελεχών των γενών Acidovorax και Fimbriimonadaceae, καθώς και νιτροποιητικών βακτηρίων των γενών Nitrosomonas και Nitrospira. Επιπρόσθετα, απομονώθηκε το στέλεχος βακτηρίου FLX-12, το οποίο ήταν ικανό να αποδομεί υψηλές συγκεντρώσεις του μυκητοκτόνου fludioxonil (250 mg/L) (Κεφάλαιο 7). Κατά τη φυλογενετική ανάλυση, το στέλεχος βακτηρίου FLX-12 εμφάνισε υψηλή φυλογενετική ομοιότητα με στελέχη του γένους Ochrobactrum. Κατά τη διερεύνηση του μεταβολικού του προφίλ, παρατηρήθηκε ιδιαίτερη προτίμηση στον μεταβολισμό αμινοξέων, κυρίως στην L-ισολευκίνη και L-προλίνη, παρουσίαζε δε ικανότητα να μεταβολίζει το πρωτοκατεχικό οξύ. Η βέλτιστη ανάπτυξη του παρατηρήθηκε σε pH 7 και σε θερμοκρασία 37 οC. Η ικανότητα του στελέχους FLX-12 να διασπά το fludioxonil εξετάστηκε σε αερόβιους βιοαντιδραστήρες διαλείποντος έργου, όπου παρατηρήθηκε υψηλή μείωση της συγκέντρωσης του fludioxonil κατά 88% εντός 5 ημερών (αρχική συγκέντρωση fludioxonil ίση με 250 mg/L). Ο ρυθμός αποδόμησης του fludioxonil βελτιώθηκε στην περίπτωση του συμμεταβολισμού και ειδικότερα όταν προστέθηκαν τα αμινοξέα L-ασπαραγίνη, L-ιστιδίνη, L-ισολευκίνη, και L-προλίνη (ένα εξ αυτών παρουσία του μυκητοκτόνου fludioxonil). Tο στέλεχος βακτηρίου FLX-12 χρησιμοποιήθηκε ως εμβόλιο σε αερόβιο βιοαντιδραστήρα ακινητοποιημένης βιομάζας, ο οποίος λειτουργούσε υπό διαφορετικούς υδραυλικούς χρόνους παραμονής (Κεφάλαιο 8). Η απόδοση του συστήματος ήταν υψηλή καθ’ όλη τη διάρκεια της λειτουργίας του, επιτυγχάνοντας απομάκρυνση του fludioxonil σε ποσοστό 98% ακόμα και σε υδραυλικό χρόνο παραμονής μίας ημέρας. Η απομάκρυνση του COD ήταν σταθερή προσεγγίζοντάς σε ποσοστό το 84%. Τα γένη βακτηρίων που επικράτησαν όσο μειωνόταν ο υδραυλικός χρόνος παραμονής, ήταν τα Aridibacter (16,54 ± 3,89%) και Rhodococcus (12,05 ± 0,74%). Πραγματοποιήθηκε επίσης η επεξεργασία υγρού αποβλήτου που περιείχε 250 mg/L μετασυλλεκτικού μυκητοκτόνου imazalil σε αερόβιο βιοαντιδραστήρα ακινητοποιημένης βιομάζας, ο οποίος είχε εμβολιαστεί με ενεργό ιλύ και λειτουργούσε υπό υδραυλικό χρόνο παραμονής 10 ημερών (Κεφάλαιο 9). Ο βιοαντιδραστήρας ακινητοποιημένης βιομάζας ήταν ικανός να απομακρύνει το imazalil σε ποσοστό 95%. Μετά από μία περίοδο προσαρμογής 15 ημερών, η απομάκρυνση του COD υπερέβη το 76%. Κατά τη διερεύνηση της μικροβιακής διαδοχής, παρατηρήθηκε αύξηση της σχετικής αφθονίας στελεχών των γενών Pseudomonas, Ochrobactrum, Stenotrophomonas, Cupriavidus, Rhodopseudomonas, Bordetella και Bellilinea, γεγονός που υποδεικνύει το σημαντικό τους ρόλο στην απομάκρυνση του imazalil. Παράλληλα, χρησιμοποιήθηκε αερόβιος βιοαντιδραστήρας ακινητοποιημένης βιομάζας οριζόντιας ροής για την επεξεργασία υγρού αποβλήτου που περιείχε τόσο fludioxonil όσο και imazalil, σε συγκέντρωση 100 mg/L έκαστο μετασυλλεκτικό μυκητοκτόνο (Κεφάλαιο 10). Κατά την λειτουργία του συστήματος υπό μειούμενους υδραυλικούς χρόνους παραμονής, σημειώθηκε υψηλή απομάκρυνση του fludioxonil που υπερέβη το 94%. Αντίθετα, η απομάκρυνση του imazalil ήταν μικρότερη του 55% καθ’ όλη τη διάρκεια λειτουργίας του συστήματος, γεγονός που υποδεικνύει την προτίμηση του μικροβιακού πληθυσμού στην αποδόμηση του fludioxonil έναντι του imazalil. Καθ’ όλη τη διάρκεια λειτουργίας του συστήματος, επικράτησαν στελέχη των γενών Pseudomonas και Azospirillum. Τέλος, υγρό απόβλητο που περιείχε υψηλή συγκέντρωση σε ortho-phenylphenol (250 mg/L) επεξεργάστηκε σε βιοαντιδραστήρα ακινητοποιημένης βιομάζας, ο οποίος λειτουργούσε υπό αερόβιες συνθήκες και διαφορετικούς υδραυλικούς χρόνους παραμονής (Κεφάλαιο 11). Κατά τη διάρκεια της λειτουργίας του συστήματος, παρατηρήθηκε σημαντική μείωση της συγκέντρωσης του ortho-phenylphenol, επιτυγχάνοντας υψηλή απομάκρυνση ίση με 99,97 ± 0,01%. Η απομάκρυνση του COD υπερέβη το 90%, ακόμα και σε υδραυλικό χρόνο παραμονής 1,6 ημερών. Κατά τη διάρκεια της λειτουργίας του βιοαντιδραστήρα υπό διαφορετικούς υδραυλικούς χρόνους παραμονής ευνοήθηκε η ανάπτυξη στελεχών των γενών Dokdonella, Terrimonas, Mesorhizobium, Aridibacter, Reyranella, Nitrospira και Sphingopyxis. Συνοψίζοντας, συμπεραίνεται ότι τα συστήματα βιοαντιδραστήρων που εξετάστηκαν ήταν ικανά να απομακρύνουν υψηλές συγκεντρώσεις μετασυλλεκτικών μυκητοκτόνων υπό διαφορετικές συνθήκες αερισμού και υδραυλικούς χρόνους παραμονής, αποτελώντας έτσι μία αποτελεσματική λύση στην επεξεργασία υγρών αποβλήτων που προέρχονται από βιομηχανίες μεταποίησης φρούτων και συσκευαστήρια φρούτων.