Διερεύνηση της αποτελεσματικότητας φυτογενών προϊόντων για τον έλεγχο της καμπυλοβακτηρίωσης στα κρεοπαραγωγά ορνίθια

Abstract

Infection with Campylobacter spp. is the most common cause of foodborne disease in humans and represents a major risk for public health. The main source of human infection is the handling and/or consumption of undercooked poultry meat, especially broiler meat. Campylobacteriosis in broilers is mainly caused by Campylobacter jejuni and Campylobacter coli. Up to 100% of the broilers in a flock can be infected with the microorganism at the slaughter age. All the microbial risk assessments concluded that the most effective intervention to reduce the prevalence of Campylobacter spp. in humans is the control of the microorganism at farm level. Reducing the population of Campylobacter spp. in poultry carcasses by 2 log10 units could lower the risk of human infection by more than 90%.Phytogenic products have been used for several years as natural additives in the feed and water of broilers due to a number of biologically positive effects, including antimicrobial ones. The frequent use of phytogenic products in the drinking water of commercial farms and the urgent need for the development of innovative methods to control the prevalence of Campylobacter spp. in broilers motivated the present study and shaped its main objectives. The first objective of the doctoral thesis was the in vitro evaluation of the antimicrobial activity of eight commercial products approved by the European Union for use in the drinking water of broilers. These products contain specific combinations of phytogenic products or organic acids. The antimicrobial activity of these commercial products was determined by the method of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) against one C. jejuni strain and one C. coli strain. To ensure comparability of results, a protocol was developed using a single method for all commercial products tested. According to the results of the in vitro study, all the selected commercial products tested were able to inhibit the growth of the Campylobacter spp. However, among the tested commercial products in the in vitro study, only the products "Herbal acid" and "AEN 350 B Liquid" were able to inhibit the growth of C. jejuni and C. coli at a lower than the maximum recommended dose concentration according to the manufacturer. However, only Herbal acid is reported as having antimicrobial properties while contributing to the health of the gastrointestinal microflora of broilers. In addition, the pH reduction caused by Herbal Acid in drinking water could be combined with the pH reduction in the gastrointestinal tract of broilers, resulting in a hostile environment for the colonization by pathogenic microorganisms, including Campylobacter spp. Furthermore, the effect of this phytogenic product on health, welfare of broilers and on the control of Campylobacter spp. has not yet been studied, despite its increasing frequency of use in poultry production. Therefore, considering all the above, the phytogenic product "Herbal Acid" was selected for further in vivo investigation. The second and main objective of the present study was to evaluate the effect of the commercial phytogenic product "Herbal Acid", based on the results of the in vitro study, on the performance, health, welfare and population of Campylobacter spp. in the ceca of broilers. Furthermore, it is the first time that the effect of the administration of this phytogenic product on the histomorphology of the intestine, the pH of the contents of the crop, duodenum, jejunum, ileum and cecum, and the viscosity of the contents of the jejunum and ileum of broilers was evaluated. Finally, the effect of experimental infection with C. jejuni and the separate administration of the phytogenic product on the performance, health and welfare of the broilers was evaluated. The experimental design involved random assignment of 128 day-old broiler chicks to 4 experimental groups of 32 broilers each. Each group consisted of 4 subgroups of 8 broilers each. The total duration of the experiment was 36 days. The experimental treatments carried out were the administration of the commercial phytogenic product Herbal Acid through the drinking water and the infection of the broilers with C. jejuni. Specifically, the experimental groups were the following four Group A: broilers that served as negative controls, Group B: broilers that received Herbal Acid, Group C: broilers that received C. jejuni infection, and Group D: broilers that received Herbal Acid and C. jejuni infection. The broilers were infected with 106 CFU/C. jejuni on the 18th day of life. According to the experimentation protocol, the body weight of the broilers was estimated on days 1, 7, 13, 18, 23 and 36, while the average daily feed intake, the feed conversion ratio, and the average daily water intake were calculated for the intervals 1-13, 14-23, 24-36 and 1-36. The European production efficiency factor was calculated for the entire experimental period (days 1-36). The clinical condition of the broilers was recorded daily. On days 7, 13, 18, 20, 23, and 36 of the experiment, a calibrated assessment of the incidence and intensity of diarrheal feces was carried out through the assessment of plumage besmirchment in the area around the cloaca. Two sampling ’points were performed, on day 23 (5 days post-infection) and day 36 (18 days post-infection). The tests performed were: (a) macroscopic evaluation of lesions in the footpads, hock burns, gizzard, liver and intestine of the broilers; (b) histomorphometric and histopathologic evaluation of tissue samples from the duodenum, jejunum and ileum of the broilers; (c) histopathologic examination of liver tissue samples from the broilers; (d) measurement of the pH of the contents of the crop, duodenum, jejunum, ileum and cecum of the broilers; (e) measurement of the viscosity of the contents of the jejunum and ileum of the broilers; (f) enumeration of C. jejuni in the crop and cecum of the broilers; (g) isolation of C. jejuni from the liver; (h) enumeration of the microflora of the cecum of the broilers. According to the results of the in vivo study, the infection of broilers with C. jejuni strain KC40 resulted in a significantly high population of C. jejuni in the ceca of the broilers, significantly increased the incidence and intensity of diarrheal feces, had negative effects on intestinal histomorphology, and resulted in a high isolation rate of the microorganism from the liver of the broilers. The administration of Herbal Acid significantly reduced the population of C. jejuni in the cecum of broilers (5 days after infection), reduced the incidence rate and the degree of intensity of diarrheal feces, improved the histomorphometric changes caused by C. jejuni in the intestine, and significantly reduced the isolation rate of the microorganism from the liver of infected broilers, without, however, limiting the transmission of C. jejuni between the broilers.

Το Campylobacter spp. είναι το πιο συχνό αίτιο τροφιμογενούς νόσου στον άνθρωπο και αποτελεί σημαντικό κίνδυνο για τη δημόσια υγεία. Η κύρια πηγή μόλυνσης του ανθρώπου είναι ο χειρισμός ή/και η κατανάλωση ατελώς θερμικά επεξεργασμένου κρέατος πουλερικών και ειδικότερα των κρεοπαραγωγών ορνιθίων. Η καμπυλοβακτηρίωση των ορνιθίων οφείλεται συνηθέστερα στη μόλυνση με το Campylobacter jejuni και το Campylobacter coli. Αναφέρεται ότι σε ηλικία σφαγής, ένα σμήνος κρεοπαραγωγών ορνιθίων ενδέχεται να είναι μολυσμένο με τον μικροοργανισμό, καταγράφοντας ποσοστό θετικότητας μεταξύ των ορνιθίων έως και 100% Όλες οι εκτιμήσεις μικροβιακού κινδύνου καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι ο έλεγχος του Campylobacter spp. σε επίπεδο εκτροφής αποτελεί το πιο αποδοτικό μέτρο παρέμβασης για τη μείωση του επιπολασμού του μικροοργανισμού στον άνθρωπο. Έχει αναφερθεί ότι η μείωση του πληθυσμού του Campylobacter spp. κατά 2 log10 στα σφάγια των ορνιθίων θα μπορούσε να περιορίσει τον κίνδυνο μόλυνσης του ανθρώπου σε ποσοστό μεγαλύτερο από 90%. Τα φυτογενή προϊόντα χρησιμοποιούνται εδώ και αρκετά χρόνια ως φυσικά προσθετικά στην τροφή και το νερό των ορνιθίων, καθώς εμφανίζουν πλήθος βιολογικών ευεργετικών δράσεων συμπεριλαμβανομένης της αντιμικροβιακής. Η συχνή χρήση εμπορικών φυτογενών προϊόντων στο πόσιμο νερό των εμπορικών εκτροφών καθώς και η επιτακτική ανάγκη για την ανάπτυξη καινοτόμων μεθόδων ελέγχου του επιπολασμού του Campylobacter spp. στα κρεοπαραγωγά ορνίθια, αποτέλεσαν το κίνητρο για την παρούσα μελέτη και διαμόρφωσαν τους βασικούς στόχους της. Ο πρώτος στόχος της διδακτορικής διατριβής αφορούσε την in vitro αξιολόγηση της αντικαμπυλοβακτηριδιακής δράσης οκτώ εμπορικών προϊόντων, τα οποία έχουν εγκριθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση για χρήση στο πόσιμο νερό των ορνιθίων, και περιέχουν συγκεκριμένους συνδυασμούς φυτογενών προϊόντων ή οργανικών οξέων. Ο καθορισμός της αντικαμπυλοβακτηριδιακής δράσης αυτών των εμπορικών προϊόντων, πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο υπολογισμού της ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (Minimal Inhibitory Concentration; MIC), έναντι ενός στελέχους C.jejuni και ενός στελέχους C.coli. Για να διασφαλιστεί η σύγκριση των αποτελεσμάτων, σχεδιάστηκε ένα πρωτόκολλο που χρησιμοποιεί μια ενιαία μέθοδο για όλα τα εμπορικά προϊόντα που εξετάσθηκαν. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της in vitro μελέτης, όλα τα εμπορικά προϊόντα που επιλέχθηκαν ανέστειλαν την ανάπτυξη των εξεταζόμενων στελεχών Campylobacter spp. Ωστόσο, από το σύνολο των εμπορικών προϊόντων που μελετήθηκαν στην in vitro μελέτη, μόνο τα προϊόντα με τις εμπορικές ονομασίες «Herbal acid» και «AEN 350 B Liquid», ανέστειλαν την ανάπτυξη του C. jejuni και του C. coli, σε μικρότερη συγκέντρωση από την μέγιστη προτεινόμενη συγκέντρωση χορήγησης, με βάση το φύλο οδηγιών χρήσης τους. Επιπρόσθετα, μόνο στο Herbal acid αναφέρονται οι αντιμικροβιακές ιδιότητες στο φύλο οδηγιών χρήσης, συμβάλλοντας παράλληλα στην υγεία της μικροχλωρίδας του γαστρεντερικού των ορνιθίων. Επιπλέον, η μείωση του pH που προκαλεί το Herbal acid στο πόσιμο νερό, θα μπορούσε να συνδυαστεί με την μείωση του pH στο γαστρεντερικό σύστημα των ορνιθίων με αποτέλεσμα την δημιουργία ενός «εχθρικού» περιβάλλοντος για τον αποικισμό των παθογόνων μικροοργανισμών συμπεριλαμβανομένου του Campylobacter spp. Επιπρόσθετα, η δράση του συγκεκριμένου φυτογενούς προϊόντος στην υγεία και την ευζωία των ορνιθίων, καθώς και στον έλεγχο του Campylobacter spp. δεν έχει μελετηθεί, παρά την αυξημένη συχνότητα χρήσης του στην πτηνοτροφία. Έτσι, λαμβάνοντας υπόψιν όλα τα παραπάνω το τελικό προϊόν το οποίο επιλέχθηκε για την περαιτέρω in vivo διερεύνηση ήταν το φυτογενές προϊόν με την εμπορική ονομασία «Herbal acid». Ο δεύτερος και κύριος στόχος της της παρούσας μελέτης ήταν η εκτίμηση της επίδρασης ενός εμπορικού φυτογενούς προϊόντος, με βάση τα αποτελέσματα της in vitro δοκιμής, στις αποδόσεις, στην υγεία, την ευζωία και τον πληθυσμό των Campylobacter spp. στα τυφλά των ορνιθίων όπου κυρίως αποικίζουν. Επίσης, αξιολογήθηκε για πρώτη φορά η επίδραση της χορήγησης του συγκεκριμένου φυτογενούς προϊόντος στην ιστομορφολογία του εντέρου, στο pH του περιεχομένου στον πρόλοβο, στο δωδεκαδάκτυλο, στη νήστιδα, στον ειλεό και στα τυφλά, καθώς και στο ιξώδες του περιεχομένου της νήστιδας και του ειλεού των ορνιθίων. Τέλος αξιολογήθηκε η επίδραση της πειραματικής μόλυνσης με C. jejuni και της χορήγησης του φυτογενούς προϊόντος ξεχωριστά στις αποδόσεις, στην υγεία και την ευζωία των ορνιθίων. Ο πειραματικός σχεδιασμός περιλάμβανε την τυχαία κατανομή 128 νεοσσών, ηλικίας 1-ημέρας, σε 4 πειραματικές ομάδες των 32 ορνιθίων. Κάθε ομάδα, αποτελούταν από 4 επιμέρους υποομάδες-επαναλήψεις των 8 ορνιθίων. Η συνολική διάρκεια του πειραματισμού ήταν 36 ημέρες. Οι πειραματικοί χειρισμοί που διενεργήθηκαν ήταν η χορήγηση του εμπορικού φυτογενούς προϊόντος Herbal acid μέσω του πόσιμου νερού και η μόλυνση των ορνιθίων με C. jejuni. Συγκεκριμένα, οι πειραματικές ομάδες ήταν οι εξής τέσσερις: Ομάδα Α: τα ορνίθια της οποίας χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες, Ομάδα Β: στα ορνίθια της οποίας χορηγήθηκε το Herbal acid, Ομάδα Γ: στα ορνίθια της οποίας διενεργήθηκε μόλυνση με C. jejuni, και Ομάδα Δ: στα ορνίθια της οποίας χορηγήθηκε το Herbal acid και διενεργήθηκε μόλυνση με C. jejuni. Τα ορνίθια μολυνθήκαν την 18η ημέρα της ζωής τους με 106 CFU/C.jejuni. Κατά την διάρκεια του πειραματισμού το σωματικό βάρος των ορνιθίων εκτιμήθηκε την 1η, 7η, 13η, 18η, 23η και 36η ημέρα, ενώ η μέση ημερήσια κατανάλωση τροφής, ο δείκτης μετατρεψιμότητας της τροφής και η μέση ημερήσια κατανάλωση νερού υπολογίστηκαν για τα διαστήματα 1η-13η, 14η-23η, 24η-36η και 1η-36η ημέρα. Ο Ευρωπαϊκός δείκτης παραγωγικότητας υπολογίστηκε για την συνολική περίοδο του πειραματισμού (1η-36η ημέρα). Η κλινική εικόνα των ορνιθίων ελεγχόταν καθημερινά. Την 7η, 13η, 18η, 20η, 23η και 36η ημέρα του πειραματισμού, διενεργήθηκε βαθμονομική εκτίμηση του ποσοστού εμφάνισης και του βαθμού έντασης διαρροϊκών κοπράνων, μέσω της εκτίμησης της ρύπανσης του πτερώματος στην περιοχή της αμάρας. Συνολικά, στον in vivo πειραματισμό πραγματοποιήθηκαν 2 δειγματοληψίες, την 23η ημέρα (5 ημέρες μετά τη μόλυνση) και την 36η ημέρα (18 ημέρες μετά τη μόλυνση). Οι εξετάσεις που διενεργήθηκαν ήταν: α) η μακροσκοπική εκτίμηση των αλλοιώσεων στα πέλματα, τους ταρσούς, το μυώδη στόμαχο, το ήπαρ και το έντερο των ορνιθίων β) η ιστομορφομετρική και ιστοπαθολογική εκτίμηση ιστοτεμαχίων από το δωδεκαδάκτυλο, τη νήστιδα και τον ειλεό των ορνιθίων, γ) η ιστοπαθολογική διερεύνηση σε ιστοτεμάχια ήπατος των ορνιθίων, δ) η μέτρηση του pH του περιεχομένου στον πρόλοβο, στο δωδεκαδάκτυλο, στη νήστιδα, στον ειλεό και στα τυφλά των ορνιθίων, ε) η μέτρηση του ιξώδους του περιεχομένου της νήστιδας και του ειλεού των ορνιθίων ζ) η βακτηριολογική καταμέτρηση των C. jejuni στον πρόλοβο και τα τυφλά των ορνιθίων, η) η απομόνωση του C. jejuni από το ήπαρ, θ) η βακτηριολογική καταμέτρηση της μικροβιακής χλωρίδας των τυφλών των ορνιθίων. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της in vivo μελέτης, η μόλυνση των κρεοπαραγωγών ορνιθίων με το στέλεχος C. jejuni KC40 οδήγησε σε σημαντικά υψηλό πληθυσμό του C. jejuni στη περιοχή των τυφλών του εντέρου των ορνιθίων, αύξησε σημαντικά τον ποσοστό εμφάνισης και το βαθμό έντασης διαρροϊκών κοπράνων, είχε αρνητικές επιπτώσεις στην εντερική ιστομορφολογία και οδήγησε σε υψηλό ποσοστό απομόνωσης του μικροοργανισμού από το ήπαρ των ορνιθίων. Η χορήγηση του Ηerbal acid μείωσε σημαντικά τον πληθυσμό του C. jejuni στα τυφλά των ορνιθίων (5 ημέρες μετά τη μόλυνση), περιόρισε το ποσοστό εμφάνισης και το βαθμό έντασης διαρροϊκών κοπράνων, βελτίωσε τις ιστομορφομετρικές μεταβολές που προκάλεσε το C. jejuni στο έντερο και περιόρισε σε σημαντικό βαθμό το ποσοστό απομόνωσης του μικροοργανισμού από το ήπαρ των μολυσμένων ορνιθίων, χωρίς ωστόσο να περιορίσει τη μετάδοση του C. jejuni μεταξύ των ορνιθίων.