Molecular mechanisms that underlie the modulation or inhibition of the function of human aminopeptidases

Abstract

Endoplasmic reticulum aminopeptidases 1 and 2 (ERAPs) and insulin-regulated aminopeptidase (IRAP) play essential roles in adaptive immunity by generating mature antigenic peptides for MHC class I presentation. Their activity shapes the peptide repertoire presented to T cells and is associated with autoimmunity, cancer, and infectious diseases, while their polymorphic variation influences disease susceptibility. As a result, these enzymes have emerged as promising therapeutic targets. However, their high homology, as well as their complex and poorly understood mechanisms of function pose challenges for selective targeting. In this context, detailed understanding of their mechanism of action, modulation and substrate specificity is necessary. Notably, their catalytic mechanism involves large conformational transitions that can be affected by both allotypic variation and small molecules’ binding. To explore these mechanisms and their therapeutic potential, I focused on three main objectives: First, I studied the allotypic variation of ERAP1, focusing on the autoimmune-related allotype 10 and its unique polymorphic positions. By performing an array of biochemical and biophysical analyses, this project revealed that allotype 10’s distinct properties stem from shifts in the conformational equilibrium likely affecting a rate limiting step in the catalytic cycle. Secondly, I investigated different mechanisms of inhibition of IRAP by small molecules targeting both the active and an allosteric site. Combining structural and computational insights with biochemical assays, I demonstrate that stabilizing specific conformations enables substrate-selective inhibition, a promising approach for targeting distinct enzymatic functions. Finally, aiming to contribute to the design of selective inhibitors for ERAP2, I studied a series of substrate analogues, based on the bestatin scaffold. This work, combining structural and biochemical analysis, yielded a potent ERAP2 inhibitor with promising selectivity and cellular activity. Overall, this research advanced our understanding of the molecular and atomic mechanisms of these enzymes and generated novel insight into modulation strategies for specific therapeutic applications.

Οι αμινοπεπτιδάσες ERAP1, ERAP2 και IRAP παίζουν ουσιαστικό ρόλο στην προσαρμοστική ανοσία, παράγοντας ώριμα αντιγονικά πεπτίδια για την παρουσίαση τους από μόρια ιστοσυμβατότητας τάξης Ι. Η ενζυμική τους δράση διαμορφώνει το σύνολο των πεπτιδίων που παρουσιάζεται στα Τ κύτταρα και έχει συσχετιστεί με αυτοανοσία, καρκίνο και λοιμώδη νοσήματα, ενώ οι πολυμορφικές τους παραλλαγές επηρεάζουν την προδιάθεση σε ασθένειες. Ως εκ τούτου, τα ένζυμα αυτά έχουν αναδειχθεί σε υποσχόμενους θεραπευτικούς στόχους. Ωστόσο, η υψηλή ομολογία και οι πολύπλοκοι και ελλιπώς κατανοητοί μηχανισμοί λειτουργίας δυσχεραίνουν την ανάπτυξη εκλεκτικών αναστολέων. Στο πλαίσιο αυτό, η λεπτομερής κατανόηση του μηχανισμού δράσης τους, της αναστολής και της ειδικότητας υποστρώματος είναι απαραίτητη. Ο καταλυτικός τους μηχανισμός περιλαμβάνει εκτεταμένες διαμορφωτικές αλλαγές, οι οποίες συνδέονται τόσο με τoυς πολυμορφισμούς όσο και με τον τρόπο αναστολής τους από μικρά μόρια. Για την μελέτη αυτής της αλληλεπίδρασης και των θεραπευτικών της δυνατοτήτων, η παρούσα εργασία εστίασε σε τρεις βασικούς στόχους: Καταρχάς μελετήθηκαν οι πολυμορφισμοί της ERAP1, εστιάζοντας στον αλλότυπο 10, που σχετίζεται με αυτοάνοσα νοσήματα, και στις μοναδικές πολυμορφικές θέσεις του. Μέσω βιοχημικών και βιοφυσικών αναλύσεων, η εργασία αυτή ανέδειξε ότι οι ξεχωριστές ιδιότητες του αλλότυπου 10 προέρχονται από μετατοπίσεις στη διαμορφωτική ισορροπία που πιθανώς επηρεάζουν κρίσιμα καταλυτικά βήματα. Περαιτέρω διερευνήθηκαν μηχανισμοί αναστολής της IRAP από μικρά μόρια που στοχεύουν τόσο στην ενεργή όσο και σε μια αλλοστερική θέση. Συνδυάζοντας γνώσεις από δομικές και υπολογιστικές μελέτες με βιοχημικές δοκιμές, βρέθηκε ότι η σταθεροποίηση συγκεκριμένων διαμορφώσεων οδηγεί σε επιλεκτική αναστολή ως προς το υπόστρωμα, μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για τη στόχευση διακριτών ενζυμικών λειτουργιών. Τέλος, με στόχο το σχεδιασμό εκλεκτικών αναστολέων της ERAP2, μελετήθηκε μια σειρά ανάλογων μπεστατίνης. Η εργασία αυτή, που περιλαμβάνει δομικές και βιοχημικές αναλύσεις, ανέδειξε έναν ισχυρό αναστολέα της ERAP2, με υποσχόμενη εκλεκτικότητα in vitro και κυτταρική δράση. Συνολικά, η παρούσα έρευνα ενισχύει την κατανόηση των μοριακών μηχανισμών λειτουργίας των ERAPs/IRAP και αναδεικνύει νέες στρατηγικές για την εκλεκτική αναστολή τους για στοχευμένες θεραπευτικές εφαρμογές.