Development of novel tissue engineering-based systems of biomimetic and functional responses of oral tissues towards dental biomaterials based on the “organ-on-a-chip” technology

Abstract

Objective: Following the EU regulations that promote the Replacement, Reduction, and Refinement on animal testing, in vitro-to-in vivo extrapolation research has gathered increasing attention. Inductively, of particular interest is the improvement of in vitro models that simulate the physiology and function of the complex oral environment and in particular the mucosa, which undergoes multiple interactions with a series of dental materials, drugs and other potentially toxic exogenous factors (e.g. microorganisms) but also undergoes significant pathological processes (aging, degeneration, carcinogenesis, inflammation, etc.) that require research evaluation. Methods and Materials: Α dynamic customized oral-mucosa-on-chip/OMC microfluidic device was manufactured via stereopithography. On the upper compartment of OMC, a tissue-engineered oral epithelium (TEOE) was developed. The lower compartment facilitated a lamina propria analogue, consisting of extracellular matrix, fibroblasts, endothelial cells, and salispheres. The system was exposed to dental materials and was assessed by a battery of mechanical and biological assays. The validation of the OMC device was performed after comparison to the ex vivo analogue of human or porcine oral mucosa tissues. For this purpose, a device (Epi-ExPer device) was designed and manufactured via stereolithography, in order to facilitate the oriented culture and exposure of the oral mucosa to external stimuli, such as prosthodontic dental materials. The Epi-ExPer device also accommodated premeability stdies of the oral mucosa. Results: The dimensional accuracy of OMC device and the optimal manufacture conditions were determined by uCT, CFD, and SEM. TEOE developed an 8- to 20-cell-layer thick stratified barrier with robust intercellular connectivity, long viability, expressing pCK. TEOE’s permeability was found similar to the one of the ex vivo analogue. TEGDMA had higher toxicity, compared to HEMA. Conclusions: OMC is a suitable tissue-engineered oral mucosa analogue and a promising tool for biocompatibility assessment of biomaterials. Epi-ExPer device offers a simple and reproducible system to evaluate the effect of external stimuli on biocompatibility and permeability of oral mucosa.

Εισαγωγή και Αντικείμενο της εργασίας: H βελτίωση των in vitro- και in vivo- μοντέλων που προσομοιώνουν τη φυσιολογία και λειτουργία των διαφόρων ανθρώπινων ιστών και οργάνων βρίσκεται σήμερα στην αιχμή της έρευνας. Σημαντική είναι η επίτευξη αξιοπιστίας και επάρκειας της προσομοίωσης ώστε με ασφάλεια να μπορούν να αντικαταστήσουν τα αντίστοιχα πειράματα με χρήση ζώων εργαστηρίου (κανόνας των 3R: Replace, Reduce and Refine της ΕΕ). Επαγωγικά, ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η βελτίωση των in vitro μοντέλων που προσομοιώνουν τη φυσιολογία και λειτουργία του πολύπλοκου στοματικού περιβάλλοντος και ιδίως του βλεννογόνου, ο οποίος υφίσταται πολλαπλώς αλληλεπίδραση με μια σειρά οδοντιατρικών υλικών, φαρμάκων και άλλων πιθανά τοξικών εξωγενών παραγόντων (πχ μικροοργανισμών) αλλά και υφίσταται σημαντικές παθολογικές εξεργασίες (γήρανση, εκφύλιση, καρκινογένεση, φλεγμονή κτλ) που χρήζουν ερευνητικής αξιολόγησης. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη μιας συσκευής μικρορροής, που βασίζεται στην τεχνολογία «Όργανο-σε-Μικροκύκλωμα» (Organ-on-Chip) με στόχο τη δυναμική καλλιέργεια ιστοτεχνολογικού ανάλογου στοματικού βλεννογόνου (Oral-Mucosa-on-Chip, OMC). Επιπρόσθετα, δημιουργήθηκε ένα ολοκληρωμένο σύστημα ελέγχου της διαπερατότητας του βλεννογόνου ύστερα από έκθεση σε τοξικές ουσίες (Epi-ExPer device), που συγκεκριμένα σχεδιάστηκε και κατασκευάστηκε με στόχο την ελεγχόμενη καλλιέργεια και έκθεση του επιθηλίου του βλεννογόνου του στόματος σε εξωγενείς χημικές ουσίες και παραπρϊόντα σημαντικών οδοντιατρικών βιοϋλικών, με δυνατότητα αξιολόγησης της διαπερατότητας και της ανθεκτικότητας αυτού. Μέθοδοι και Υλικά: Αρχικά δημιουργήθηκε ένα ιστοτεχνολογικό ανάλογο στοματικού επιθηλίου (tissue- engineered oral epithelium - TEOE) που αναπτύχθηκε από καλλιέργεια ΤR146 επιθηλιακών κυττάρων σε 3D δομή εντός καλλιεργητικών πηγαδιών (in vitro) με πορώδη μεμβράνη στη βάση τους. Έγινε αξιολόγηση διαφορετικών συνθηκών καλλιέργειας, και πιο συγκεκριμένα συγκρίθηκαν η συμβατική καλλιέργεια (submerged - SUB) και η μέθοδος καλλιέργειας με διεπιφάνεια αέρα- υγρού (air-liquid interface - ALI) σε τυπικό θρεπτικό μέσο CCM ή θρεπτικό μέσο εμπλουτισμένο με τον παράγοντα αύξησης των κερατινοκυττάρων-KGS. Η δομή του σχηματιζόμενου επιθηλίου μελετήθηκε ιστολογικά με χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης και με ανοσοιστοχημεία (Immunohistochemistry - IHC) για την έκφραση κερατινών (panCytokeratin - pCK) στο οπτικό μικροσκόπιο προς επιβεβαίωση της επιθηλιακής διαφοροποίησης. Η διαπίστωση της τρισδιάστατης αρχιτεκτονικής ακεραιότητας του επιθηλίου έγινε με χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διέλευσης (transmission electron microscopy - TEM), που έδωσε πληροφορίες για το σχηματισμό συνδέσεων μεταξύ των επιθηλιακών κυττάρων. Επιπλέον αξιολογήθηκε η λειτουργία του επιθηλίου αυτού ως ιστικού φραγμού με την μέτρηση της διεπιθηλιακής ηλεκτρικής αντίστασης (transepithelial electrical resistance - TEER) και της ποσοτικοποίησης της διαπερατότητας του επιθηλίου με τη μέτρηση της διαπερατότητας αυτού σε καλσεΐνη με την τεχνική της φασματοφθοριομετρίας. Τέλος η μακροχρόνια βιωσιμότητα του TEOE προσδιορίστηκε με χρώση ζωντανών/νεκρών κυττάρων. Στο δεύτερο μέρος της η διατριβή περιλάμβανε την κατασκευή συσκευής μικρορροής, που βασίζεται στην τεχνολογία «Όργανο-σε-Μικροκύκλωμα» (Organ-on-Chip) με στόχο τη δυναμική καλλιέργεια ιστοτεχνολογικού ανάλογου στοματικού βλεννογόνου (Oral-Mucosa-Chip-OMC) με τη χρήση στερεολιθογραφίας (stereolithography - SLA). Η πιστότητα στον όγκο και στις διαμέτρους των εκτυπωμένων συσκευών σε σχέση με το ψηφιακό ανάλογό τους αξιολογήθηκε μέσω μικροεστιακής υπολογιστικής τομογραφίας (micro- computed tomography - μCT), ενώ η ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (scanning electron microscopy - SEM) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των λεπτομερειών της επιφάνειας. Οι μηχανικές ιδιότητες της συσκευής αξιολογήθηκαν με δοκιμές νανο- εντύπωσης και συμπίεσης. Επιπλέον, μελέτες υπολογιστικής ρευστοδυναμικής (computational fluid dynamics - CFD) αξιοποιήθηκαν για τη βελτιστοποίηση των δυνάμεων που ασκούνταν στην περιοχή της καλλιέργειας των ιστών. Η συσκευή OMC περιείχε δύο θαλάμους (άνω και κάτω θάλαμος), που χωρίζονταν από μία πορώδη μεμβράνη. Ο άνω θάλαμος περιείχε το επιθηλιακό ανάλογο (TEOE), ενώ ο κάτω θάλαμος ανάλογο του χορίου. Το χόριο αυτό περιλάμβανε εξωκυττάρια μήτρα κολλαγόνου τύπου Ι / ινικής, ανθρώπινους ουλικούς ινοβλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVECs) και σφαιροειδή αδενικού επιθηλίου σιαλογόνων αδένων («σαλισφαίρια»-salispheres) προερχόμενων από βλαστικά κύτταρα που είχαν απομονωθεί από ελάσσονες σιελογόνους αδένες κάτω χείλους ανθρώπου. Οι συνθήκες δυναμικής καλλιέργειας του OMC κυμάνθηκαν σε ταχύτητες ροής 1-4 μL/min. Στο τρίτο μέρος της διατριβής έγινε εστίαση στη δημιουργία μοντέλου-συσκευής ελέγχου διαπερατότητας (Epi-ExPer) που σχεδιάστηκε σύμφωνα με τις ανάγκες καλλιέργειας, έκθεσης και ελέγχου διαπερατότητας του βλεννογόνου, και κατασκευάστηκε μέσω στερεολιθογραφίας. Μέσα στη συσκευή αυτή τοποθετήθηκαν ιστοτεμάχια στοματικού βλεννογόνου ανθρώπινης και χοίρειας προέλευσης και οι καλλιέργειες των ιστοτεμαχίων αυτών διατηρήθηκαν υπό σωστά προσανατολισμένες συνθήκες ALI και οι εκθέσεις στους εξωγενείς παράγοντες πραγματοποιήθηκαν με ελεγχόμενο και αναπαραγώγιμο τρόπο. Οι εξωγενείς παράγοντες που μελετήθηκαν ήταν τα ρητινώδη μονομερή ΗΕΜΑ (Υδροξυαιθυλ)μεθακρυλικό-(Hydroxyethyl)methacrylate) και TEGDMA (Διμεθυλαιθέρας τετρααιθυλενογλυκόλης-Tetraethylene glycol dimethyl ether) σε αραιώσεις (HEMA – low: 1 mM, HEMA – high: 4 mM, TEGDMA – low: 0.5 mM, και TEGDMA – high: 3 mM). Η επίδραση αυτών των παραγόντων αξιολογήθηκε εξετάζοντας τις αλλαγές στη μορφολογία, τη συνολική βιωσιμότητα, και τη διαπερατότητα του επιθηλιακού τμήματος του βλεννογόνου. Αποτελέσματα: Το καλλιεργημένο επιθήλιο ΤΕΟΕ σε συνθήκες ALI με παρουσία του παράγοντα ανάπτυξης κερατινοκυττάρων (ALI-KGS), οδήγησε στη δημιουργία σαφώς διαφοροποιημένου επιθηλίου πάχους 8 έως 20 κυτταρικών στοιβάδων με έντονη έκφραση κερατινών pCK και με ανάπτυξη ισχυρών διακυτταρικών συνδέσεων, που συνολικά λειτουργεί ως ιστικός φραγμός. Σημαντικό εύρημα αποτέλεσε το γεγονός ότι οι τιμές της διεπιθηλιακής ηλεκτρικής αντίστασης για το TEOE, που προέκυψε στην ομάδα ALI-KGS ήταν υψηλότερες (περίπου 80 Ω*cm2) σε σύγκριση με αυτές που παρατηρήθηκαν σε άλλες συνθήκες καλλιέργειας. Όταν εκτέθηκε αυτός ο επιθηλιακός ιστός σε οδοντιατρικά ρητινώδη μονομερή, η δομική ακεραιότητα και η αρχιτεκτονική τροποποιήθηκε. Διατυπώθηκε κενοτοπίωση των επιθηλιακών κυττάρων, υδρωπική εκφύλιση και καταστροφή αυτών λόγω απόπτωσης. Στη συσκευή OMC ανοικτού τύπου, η οποία διέθετε δύο διασυνδεδεμένους θαλάμους, για μακροχρόνια δυναμική καλλιέργεια του ιστοτεχνολογικού αναλόγου του στοματικού βλεννογόνου ο σχεδιασμός του διαύλου μικροροής με διαχωριζόμενη είσοδο εξασφάλισε ομοιόμορφη κατανομή και συμμετρική ταχύτητα ροής σε όλη την περιοχή καλλιέργειας. Η βιωσιμότητα των κυττάρων διατηρήθηκε πάνω από 90% για 37 ημέρες καλλιέργειας ενώ τόσο η ανάλυση μCT όσο και η SEM απέδειξαν ότι η γωνία κατασκευής 0° οδήγησε στην υψηλότερη ακρίβεια στην εκτύπωση με SLA. Επιπλέον, η μελέτη CFD αποκάλυψε ότι οι γωνίες κατασκευής 0° και 30° αναπαρήγαγαν με τη μεγαλύτερη πιστότητα την ταχύτητα ροής του διαύλου που προβλέπεται από το αρχικό μοντέλο (computer - aided design – CAD). Σε υψηλές συγκεντρώσεις ρητινωδών μονομερών τόσο το HEMA (4 mM) όσο και τοTEGDMA (3 mM) επέφεραν μείωση της βιωσιμότητας του ιστού σε 74% για το HEMA και σε 53% για το TEGDMA, με το TEGDMA ειδικά να αυξάνει επιπρόσθετα τη διαπερατότητα του μέσω του επιθηλίου, φτάνοντας τα 2 μg/cm2 της διερχόμενης καλσεΐνης. Οι προαναφερθέντες ξενοβιοτικοί παράγοντες επηρέασαν την ακεραιότητα του επιθηλίου, προκαλώντας κενοτοπιώδη εκφύλιση στα επιθηλιακά κύτταρα αλλά και αντιρροπιστική αύξηση της έκφρασης των κερατινών ως ένα μέσο ιστικής αντίδρασης. Συμπεράσματα: Στη μελέτη αυτή για πρώτη φορά περιγράφεται η κατασκευή ιστοτεχνολογικού στοματικού επιθηλιακού αναλόγου που προσομοιάζει μορφολογικά και λειτουργικά με τις βιολογικές φυσιολογικές ιδιότητες του στοματικού επιθηλίου και αποτελεί αξιόπιστο σύστημα ελέγχου της βιοσυμβατότητας των οδοντιατρικών υλικών. Στα πλεονεκτήματα της συσκευής OMC που κατασκευάστηκε περιλαμβάνεται το ότι προσαρμόζεται εύκολα σε σχέση με τις μεταβολές των διαστάσεων εάν αυτό διευκολύνει τις πειραματικές συνθήκες, είναι εύκολη στην κατασκευή, φιλική προς τα κύτταρα και ακολουθεί μοτίβο ανοιχτού-τύπου συσκευής, που μπορεί να αξιοποιηθεί για πειράματα ολόκληρων ιστοτεμαχίων στοματικού βλεννογόνου (whole-mount experiments). Επιπρόσθετα, η συσκευή ελέγχου διαπερατότρητας Epi-ExPer που αναπτύχθηκε προσφέρει ένα απλό και αναπαραγώγιμο σύστημα μελέτης για την αξιολόγηση των αλληλεπιδράσεων του στοματικού βλεννογόνου με εξωτερικά προστιθέμενες ουσίες-μόρια. Αυτό προσφέρει ένα εργαλείο αξιολόγησης της βιοσυμβατότητας και της διαπερατότητας των ex vivo ιστοτεμαχίων στοματικού βλοννογόνου, ύστερα από έκθεση σε τοξικά ερεθίσματα. Επιπλέον, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως εργαλείο για μελέτη της παθολογίας του επιθηλίου (πχ καρκινογένεση). Συνολικά, τα δύο συστήματα ελέγχου βιοσυμβατότητας που αναπτύχθηκαν στα πλαίσια της παρούσας διατριβής προσφέρουν αξιόπιστα βιολογικά μοντέλα με σημαντική καινοτομία την in vitro δυναμική και μακροχρόνια καλλιέργεια στοματικού επιθηλίου για τον έλεγχο της βιωσιμότητας και αποτελεσματικότητας που επιθηλιακού φραγμού κατόπιν έκθεσης σε οδοντιατρικά αποκαταστατικά βιοϋλικά. Αυτό το γεγονός συμβάλλει στην αξιόπιστη υποκατάσταση της χρήσης πειραματοζώων στην έρευνα σε συμμόρφωση και εφαρμογή της Ευρωπαϊκής πολιτικής (κανόνας των 3R).