Διερέυνηση της διασποράς, της παρουσίας παθογόνων μικροοργανισμών, των υποπληθυσμών και των παραγόντων επικινδυνότητας για το άκαρι Dermanyssus gallinae σε αβγοπαραγωγές όρνιθες στην Ελλάδα, καθώς και in vitro αξιολόγηση των νανοσωματιδίων αργύρου για την καταπολέμησή του.

Abstract

Dermanyssus gallinae is considered as one of the most important ectoparasites in the modern laying hen industry. It is a haematophagous acari that reduces the egg production and egg quality and also causes high morbidity and mortality in hens, resulting in economic losses of approximately 231-360 million euros annually in Europe. The aim of the current PhD research was to investigate the prevalence of D. gallinae in Greek laying hen farms (both industrial and backyard), the vectorial potential of D. gallinae, identify different haplotypes and the phylogenetic relationships of the acari in Greece, as well as determine potential risk factors that increase the farms’ infestation risk. Furthermore, in vitro bioassays were carried out to investigate the efficacy of silver nanoparticles (AgNPs) as an alternative method to control D. gallinae. Towards this end, the prevalence of D. gallinae in laying hen farms was investigated in 33 industrial and 51 backyard farms, across different regions of Greece. The farms were sampled using specially designed cardboard traps and questionnaires were filled in by the poultry farmers to determine potential risk factors. Mites were identified using morphological keys via microscopy and the mitochondrial COI gene was amplified by PCR. Microbiological cultures were carried out with selective substrates for different bacteria including Salmonella gallinarum, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Staphylococcus spp., Enterobacteriaceae, and Pasteurella multocida. In addition, PCR assays were carried out for Coxiella burnetii, Erysipelothrix rhusiopathiae, Chlamydia psittaci, Mycoplasma synoviae and L. monocytogenes using specific primers. The genetic diversity of D. gallinae was analysed by constructing a phylogenetic tree and a Median-Joining network based on the COI gene. Lastly, in vitro contact toxicity bioassays were carried out for 24 h with negative controls, 20, 40, 60, or 80 ppm AgNPs. Scanning electron microscopy was employed on mites treated with 80 ppm AgNPs to elucidate the potential mechanism of action of AgNPs. In total, 84 poultry farms were sampled, with a cumulative production capacity of 1,080,900 hens. The overall prevalence was 75.0% and was higher in backyard farms (80.4%) compared with industrial ones (66.7%), varying regionally from 66.7 to 90.9%. Most farms had low to moderate infestation levels, and the mean number of mites ± standard error per positive farm was 2,450 ± 440. Several poultry farmers were using off-label treatment methods to control D. gallinae, such as petroleum, and almost half of the farmers were unaware that their farm was infested with mites. Statistical analyses of the potential risk factors revealed that the regular cleaning of farms, i.e. regardless of the presence of mites, and farms with a mechanical ventilation system had a significantly lower infestation risk, compared with farms not cleaned regularly and those using a natural ventilation system, respectively. Farms with low humidity (<60% RH) had a clear tendency towards a lower infestation risk, although the difference was not statistically significant. Regarding the pathogen detection from the times, microbiological cultures and PCR assays confirmed the vectorial potential of D. gallinae. Bacteriological cultures from 39 farms were positive for E. coli, L. monocytogenes, S. aureus, Coagulase-Negative Staphylococci, and/or Enterobacteriaceae. The high prevalence of E. coli (74.3%) highlights the close association of D. gallinae with this specific pathogen. Moreover, the current PhD research describes the first molecular isolation of L. monocytogenes from D. gallinae, confirming that the mites can carry this food-borne pathogen. Regarding nanoparticles, AgNPs displayed strong acaricidal activity, and mortality rates were significantly different between groups and increased by AgNPs concentration. Overall mean LC50, LC90, and LC99 values were 26.5, 58.8, and 112.3 ppm, respectively. Scanning electron microscopy micrographs of mites treated with AgNPs at 80 ppm revealed considerable cracks in their chitin exoskeleton and leg detachments. The potential mechanism of action suggested was the interaction of AgNPs with chitin in the mite’s exoskeleton or peritrophic membrane. Phylogenetic analysis revealed the existence of significant genetic diversity of D. gallinae in Greece as 7 haplotypes were identified, 6 of which were novel. The high homologies (99.5% to 100%) with haplotypes and sequences from countries neighbouring Greece such as Israel and Italy reflect the cross-border transmission of the parasite through commercial activities (e.g. transport of cages, eggs, cartons and/or other equipment). The phylogenetic tree and the Median-Joining network allowed the separation of haplotypes into 4 distinct haplogroups, while the Greek haplotypes were separated into 2 haplogroups. In addition, the presence of multiple haplotypes within single poultry farms and the presence of common haplotypes in farms across distant geographical areas (e.g., Macedonia - Peloponnese), suggest the repeat infestations of farms and the exchange of D. gallinae populations between farms through trade routes. In conclusion, the current PhD thesis contributes to the understanding of the prevalence and zoonotic potential of D. gallinae in Greece, while exploring promising new methods for the alternative control of the mite, using nanomedicine. These findings can be used to optimise control strategies for D. gallinae, with the aim of reducing the economic losses for poultry farmers while improving the health and welfare of hens.

Το Dermanyssus gallinae αποτελεί σήμερα ένα από τα σημαντικότερα εξωπαράσιτα στις εκτροφές ορνίθων αβγοπαραγωγής. Λόγω της αιμομυζητικής του δράσης ευθύνεται για οικονομικές απώλειες, περίπου 231-360 εκατομμυρίων ευρώ ετησίως στην Ευρώπη, οι οποίες οφείλονται κυρίως στη μείωση της αβγοπαραγωγής και της ποιότητας των αβγών, στην υψηλή νοσηρότητα και στους θανάτους των πτηνών. Επιπλέον, το άκαρι έχει διαπιστωθεί ότι μπορεί να διαβιβάζει σημαντικούς παθογόνους μικροοργανισμούς οι οποίοι μπορούν να προσβάλλουν τα πτηνά και να απειλήσουν τη Δημόσια Υγεία. Σκοπός της παρούσας έρευνας ήταν η διερεύνηση της διασποράς του D. gallinae στις ελληνικές εκτροφές ορνίθων αβγοπαραγωγής (εντατικές και οικόσιτες), της παρουσίας παθογόνων μικροοργανισμών στο D. gallinae, η ταυτοποίηση των πιθανών απλοτύπων του και φυλογενετικών σχέσεών του στην Ελλάδα, καθώς και ο προσδιορισμός των πιθανών παραγόντων επικινδυνότητας που ευνοούν τη μόλυνση των εκτροφών. Παράλληλα, αξιολογήθηκε in vitro η δράση των νανοσωματιδίων αργύρου (AgNPs) ως εναλλακτικός τρόπος καταπολέμησης του D. gallinae. Για τη συλλογή των ακάρεων εξετάστηκαν 33 εντατικές και 51 οικόσιτες εκτροφές από διάφορες περιοχές της Ελλάδας, χρησιμοποιώντας ειδικές παγίδες και ερωτηματολόγια για τη διερεύνηση των πιθανών παραγόντων κινδύνου. Τα ακάρεα ταυτοποιήθηκαν μορφολογικά με μικροσκόπηση και μοριακά με την ενίσχυση του μιτοχονδριακού γονιδίου COI με PCR. Παράλληλα, διενεργήθηκαν μικροβιολογικές καλλιέργειες με υποστρώματα για την ανίχνευση των παθογόνων Salmonella gallinarum, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Staphylococcus spp., Enterobacteriaceae, και Pasteurella multocida, και μοριακή διερεύνηση με τη χρήση PCR για τα Coxiella burnetii, Erysipelothrix rhusiopathiae, Chlamydia psittaci, Mycoplasma synoviae και L. monocytogenes. Η γενετική ποικιλομορφία του D. gallinae αναλύθηκε μέσω της κατασκευής φυλογενετικού δέντρου και δικτύου Median-Joining βάσει του γονιδίου COI. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν in vitro βιοδοκιμές σε τρυβλία Petri με όμοιες ομάδες ακάρεων, διαφορετικές συγκεντρώσεις AgNPs και αρνητικούς μάρτυρες με απιονισμένο νερό. Η διερεύνηση του πιθανού μηχανισμού δράσης των νανοσωματιδίων έγινε με τη χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου. Συνολικά εξετάστηκαν 84 εκτροφές αθροιστικής δυναμικότητας 1.080.900 ορνίθων και τα αποτελέσματα έδειξαν πως το D. gallinae είναι ευρέως διαδεδομένο τόσο σε εντατικές (66,7%) όσο και σε χωρικές-οικόσιτες (80,4%) εκτροφές ορνίθων αβγοπαραγωγής, με το συνολικό επιπολασμό του παρασίτου στην Ελλάδα στο 75%. Οι περισσότερες εκτροφές είχαν μικρή προς μέτρια μόλυνση, και ο μέσος αριθμός ακάρεων μαζί με το τυπικό σφάλμα ανά θετική εκτροφή ήταν 2.450 ± 440. Αρκετοί πτηνοτρόφοι χρησιμοποιούσαν μη εγκεκριμένες μεθόδους αντιμετώπισης του D. gallinae, όπως πετρέλαιο, και το 46,7% των πτηνοτρόφων αγνοούσε πως η εκτροφή τους ήταν μολυσμένη με ακάρεα. Η στατιστική ανάλυση των πιθανών παραγόντων επικινδυνότητας έδειξε ότι οι εκτροφές που εφαρμόζουν τακτικά τα μέτρα ελέγχου, δηλαδή ανεξαρτήτως της παρουσίας των ακάρεων, καθώς και αυτές που διαθέτουν τεχνητό (κλειστό) σύστημα αερισμού έχουν σημαντικά χαμηλότερη πιθανότητα μόλυνσης με D. gallinae. Η υγρασία <60% δεν ήταν σημαντικός παράγοντας κινδύνου αλλά σχετιζόταν με χαμηλότερη πιθανότητα μόλυνσης. Επιπλέον, επιβεβαιώθηκε ο ρόλος του D. gallinae ως μηχανικού φορέα παθογόνων μικροοργανισμών. Οι καλλιέργειες με ακάρεα από 39 εκτροφές ήταν θετικές για E. coli, L. monocytogenes, S. aureus, Coagulase-Negative Staphylococci, και Enterobacteriaceae. Τα υψηλά ποσοστά θετικών καλλιεργειών για E. coli (74,3%) αναδεικνύουν τη στενή συσχέτιση του D. gallinae με το συγκεκριμένο παθογόνο. Επιπλέον, περιγράφεται η πρώτη μοριακή απομόνωση της L. monocytogenes από το D. gallinae, επιβεβαιώνοντας και διευρύνοντας το ρόλο του παρασίτου ως διαβιβαστή του συγκεκριμένου τροφιμογενούς παθογόνου. Όσον αφορά τη χρήση των νανοσωματιδίων αργύρου, οι βιοδοκιμές έδειξαν ότι τα AgNPs παρουσιάζουν σημαντική ακαρεοκτόνο δράση, με υψηλά ποσοστά θνησιμότητας ακόμη και σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Οι μικροφωτογραφίες με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης έδειξαν ρωγμές στον εξωσκελετό και αποκολλήσεις άκρων στα ακάρεα, με τον προτεινόμενο μηχανισμό δράσης να είναι η αλληλεπίδραση των νανοσωματιδίων με τη χιτίνη στον εξωσκελετό των ακάρεων. Η φυλογενετική ανάλυση ανέδειξε την ύπαρξη σημαντικής γενετικής ποικιλομορφίας του D. gallinae στην Ελλάδα καθώς ταυτοποιήθηκαν 7 απλότυποι, εκ των οποίων 6 ήταν νέοι. Οι υψηλές ομολογίες (99,5% έως 100%) με ορισμένους απλοτύπους και αλληλουχίες από χώρες όπως το Ισραήλ και η Ιταλία, αντικατοπτρίζουν τη διασυνοριακή μετάδοση του παρασίτου μέσω εμπορικών δραστηριοτήτων (π.χ. μεταφορά κλωβοστοιχιών, αβγών ή άλλου εξοπλισμού). Το φυλογενετικό δέντρο και το δίκτυο Median-Joining έδειξαν την παρουσία 4 διακριτών απλοομάδων για το άκαρι, και οι ελληνικοί απλότυποι διαχωρίζονται σε 2 απλοομάδες. Επιπλέον, η παρουσία πολλαπλών απλοτύπων εντός ορισμένων εκτροφών καθώς και η παρουσία κοινών απλοτύπων σε εκτροφές από απομακρυσμένα γεωγραφικά διαμερίσματα (π.χ. Μακεδονία - Πελοπόννησος) ενισχύουν την υπόθεση των επαναλαμβανόμενων μολύνσεων των εκτροφών και της ανταλλαγής πληθυσμών D. gallinae μεταξύ των εκτροφών μέσω του εμπορίου. Συμπερασματικά, η παρούσα διατριβή συμβάλλει στην κατανόηση της διασποράς και της ζωονοσογόνου δυναμικής του D. gallinae στην Ελλάδα, ενώ παράλληλα διερευνά νέες προοπτικές για την εναλλακτική καταπολέμησή του μέσω της νανοτεχνολογίας. Τα ευρήματα μπορούν να αξιοποιηθούν για τη βελτιστοποίηση των στρατηγικών ελέγχου του D. gallinae, με σκοπό τη μείωση των οικονομικών απωλειών για τους πτηνοτρόφους και τη βελτίωση της υγείας των εκτρεφόμενων ορνίθων.