Προσδιορισμός και τύχη στο περιβάλλον άκρως έμμονων και άκρως κινούμενων ρύπων με σύγχρονες τεχνικές φασματομετρίας μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητας

Abstract

The European Green Deal sets an ambitious target of achieving zero pollution by 2050 (European Commission, 2019). However, the detection of more and more compounds in different environmental matrices highlights the need to prioritize and develop new analytical techniques for their identification and removal. The German Environment Agency (UBA) has suggested that new hazard classifications, such as Persistent and Mobile (PM), Persistent, Mobile, and Toxic (PMT), and very Persistent and very Mobile (vPvM), should be incorporated into the streamlined process for identifying substances of very high concern (SVHC) under a harmonized Classification, Labelling, and Packaging (CLP) system. The "PM concept," introduced in 2014 and later refined in 2019, is based on the inherent properties of persistence and mobility, indicating that these substances can bypass natural barriers, quickly spread throughout the water cycle, and ultimately contaminate water resources. This recognition provided the German Environment Agency (UBA) and the Norwegian Geotechnical Institute (NGI) with a foundation to tackle the challenge of establishing the first PM criteria, with support from the European Commission. However, by the end of 2022, discussions among European Competent Authorities for REACH and CLP Regulation (Classification, Labelling, and Packaging) were still ongoing regarding whether Persistent Mobile Organic Compounds (PMOCs) should be classified as "hazardous" under the European Classification Labelling and Packaging Regulation EC 1278/2008. Recent evaluations have reconsidered the adequacy of persistence and mobility under the REACH regulation as the sole criteria, factoring in the likelihood of substances reaching surface or groundwater. The isolation and analysis of these compounds represent a significant challenge for the scientific community. The focus of Environmental Analytical Chemistry has shifted towards the development of new, reliable sample pretreatment techniques. Recently, several new techniques have been developed that minimize or eliminate the use of organic solvents, reduce overall analysis time, are more cost-effective and simpler, while also offering high sensitivity and selectivity. In this context, the present dissertation includes a comparison of commercially available materials for the reliable determination of multiple vPvM/PMT categories in aqueous samples using solid-phase extraction (SPE). To achieve optimal performance, various analytical protocols were tested, including the evaluation of different extraction microcolumns, various sample pH levels, and different solvents for washing and elution. The recoveries for the compounds under study fell within acceptable limits (70-120%). Linearity was excellent in all cases (r2>0.997). The validation of the developed multi-residue methods was carried out in accordance with the current European legislation, as defined in directives 2002/657/EC and SANTE 11813/2017. Additionally, for the extraction of aqueous samples, another widely used technique, dispersive solid-phase extraction (dSPE), was chosen, where both commercial and non-commercial materials, including Fe-based metal-organic frameworks (MOFs) and chitosan, were tested. The specially both of the modified materials provided acceptable recoveries. The next step of the dissertation involved selecting at least three representative vPvM/PMT compounds from different chemical categories (climbazole, tiamulin, DOSS) for photolysis in spiked aqueous samples with the aim of conducting kinetic studies and identifying the structure of the resulting transformation products (TPs). To ensure a holistic approach, a search for these compounds in environmental samples was also conducted. To begin with climbazole, a novel suspect-screening workflow was developed and optimized by cross-comparing the results of the identified photo-TPs against literature data to create an enhanced HRMS- database for environmental investigations of climbazole’s TPs in the water cycle. In total, 28 TPs were identified, 14 of which were reported for the first time. Isomerism, dechlorination, hydroxylation, and cleavage of the ether or C- N bond are suggested as the main transformation routes. A screening of climbazole’s TPs was conducted in wastewater, leachates, surface, and groundwater, revealing a maximum concentration of 350 ng/L in groundwater. In silico and in vitro methods were used for toxicity assessment, indicating toxicity for climbazole and some TPs. What is more, for tiamulin, in total, 32 TPs were identified, with 18 of them being pioneeringly reported. The principal transformation pathways appeared to involve hydroxylation, oxidation, dealkylation, and the cleavage of the C-O bond. Additionally, a comprehensive monitoring of tiamulin and its TPs in various environmental compartments, including samples from livestock units, leachates, surface water, and groundwater was accomplished. The highest concentration was observed in solid samples from the livestock unit at 2847 ng/g. Furthermore, both the in silico and in vitro methods to assess the toxicity of tiamulin and its TPs were performed. The results indicated that TIA and many TPs exhibit an alarming toxicity. Finally for DOSS, a total of 34 TPs were found;33 of these were originally reported for the first time. Hydroxylation, oxidation, and dealkylation are the primary transformation processes of DOSS. Furthermore, a thorough monitoring of DOSS and its TPs was carried out in a variety of environmental compartments, including samples from wastewater treatment plants, leachates, surface water, and groundwater. In groundwater samples, the average concentration was calculated at a concentration of 183 ng/L. The final step of the dissertation was the monitoring of (potentially) PMOCs in different environmental matrices. These substances are known for their affinity for water, resistance to environmental degradation, and potential adverse effects on human health and the environment, particularly when classified as toxic. Accordingly, a three-year monitoring study (2021−2023) was carried out at a WWTP in Northern Greece (Thessaloniki) in surface and in ground water samples, utilizing High-Resolution Mass Spectrometry (HRMS) technology to detect (potentially) PMOCs. To begin with WWTPs monitoring process was based on two basic approaches of HRMS analysis: target and suspect screening. A total number of 2,500 different potential PMOCs list was created based on the available literature. 55 of them were identified with the target analysis approach of at least one analyzed sample. The results indicated that antihypertensives and beta-blockers were among the most frequently detected PMOCs categories during the sampling period. Specifically, valsartan and irbesartan exhibited substantial increases in concentration, surpassing 5000 ng/L in influent samples and 1000 ng/L in effluent samples. Additionally, the study employed suspect analysis, incorporating potential substances from the literature to enhance the monitoring program. As a result, the list of identified compounds was enhanced with 16 more compounds with a Level 2b identification. This was complemented by retrospective analysis techniques to identify compounds that are challenging to obtain as standard compounds. Regarding the presence of (potentially) PMOCs in surface water especially in 18 different lakes and Axios river was performed. To begin with, Diuron was detected in two out of 18 studied lakes. Specifically, in Lake Amvrakia, its maximum concentration was recorded at 19.2 ng/L. The compound with the highest recorded concentration was carbendazim, with a detection frequency of 39%. Specifically, the maximum concentration was recorded at 194.6 ng/L in Lake Voulkaria and 88 ng/L in Lake Doirani. Regarding pharmaceutical compounds, the detectable concentrations were significantly lower, but with a relatively high detection frequency. Special attention should be given to the compound diclofenac, which reached a concentration of 144 ng/L in Lake Trichonida. In the case of the Axios River, the detected pharmaceutical compounds belong to various pharmaceutical categories. Two of the most prominent compounds detected were valsartan and losartan. Specifically, valsartan was detected at a concentration greater than 1000 ng/L and with a detection frequency exceeding 60%. Similarly, losartan also exhibited a high detection frequency. Finally, regarding groundwater, the total concentration of detectable pesticides did not exceed 60 ng/L, with the exception of fluometuron, which surpassed 180 ng/L in one of the analyzed samples. As for the detection of pharmaceutical compounds in groundwater, particular attention should be given to climbazole, which reached a maximum concentration of over 350 ng/L. Additionally, high levels of fluconazole were detected (50 ng/L), although not exceeding those of climbazole. The study was concluding by estimating the environmental risks. The findings highlight the ecological risks associated with elevated PMOCs levels and emphasize the need for continuous monitoring and regulatory measures to mitigate potential environmental impacts. Finally, the study contributes to understanding the complex interactions between environmental factors, PMOCs consumption, and water pollution.

Η Ευρωπαϊκή Πράσινη Συμφωνία θέτει τον φιλόδοξο στόχο της μηδενικής ρύπανσης έως το 2050. Παρόλα αυτά η ανίχνευση όλο και περισσότερων ενώσεων σε διαφορετικά περιβαλλοντικά υποστρώματα αναδεικνύει την ανάγκη ιεράρχησης και ανάπτυξης νέων αναλυτικών μεθόδων για τον προσδιορισμό και την απομάκρυνση τους. Σύμφωνα με την Ομοσπονδιακή Υπηρεσία Περιβάλλοντος της Γερμανίας (German Environment Agency, UBA), νέες κατηγορίες κινδύνου όπως οι έμμονες και κινούμενες ενώσεις (Persistent and Mobile, PM), οι έμμονες, κινούμενες και τοξικές ενώσεις (Persistent, Mobile and Toxic, PMT), και οι άκρως έμμονες και άκρως κινούμενες ενώσεις (very Persistent and very Mobile, vPvM) θα πρέπει να συμπεριληφθούν στη διαδικασία αξιολόγησης για τον καθορισμό των ουσιών πολύ υψηλής ανησυχίας (Substances Of Very High Concern, SVHC), σύμφωνα με τον κανονισμό για την Ταξινόμηση, Επισήμανση και Συσκευασία (Classification, Labelling and Packaging, CLP). Η έννοια "PM," η οποία αρχικά εισήχθη το 2014 και στη συνέχεια αναθεωρήθηκε το 2019, βασίζεται στα εγγενή χαρακτηριστικά της επίμονης παρουσίας και κινητικότητας, δείχνοντας ότι αυτές οι ουσίες μπορούν να ξεπεράσουν φυσικά εμπόδια, να διαδοθούν γρήγορα στον υδρολογικό κύκλο και τελικά να ρυπάνουν τους υδάτινους πόρους. Η προαναφερθείσα αναγνώριση αποτέλεσε εφαλτήριο για την Ομοσπονδιακή Υπηρεσία Περιβάλλοντος της Γερμανίας σε συνεργασία με το Νορβηγικό Γεωτεχνικό Ινστιτούτο (Norwegian Geotechnical Institute, NGI), για να αντιμετωπιστεί η πρόκληση του καθορισμού των πρώτων κριτηρίων PM. Η διευκρίνιση αυτή πραγματοποιήθηκε με τη συμβολή της Ευρωπαϊκής Επιτροπής. Ωστόσο, έως τα τέλη του 2022, οι διαβουλεύσεις μεταξύ των Ευρωπαϊκών Αρμόδιων Αρχών για τον κανονισμό REACH και CLP σχετικά με το αν οι Έμμονες Κινούμενες Οργανικές Ενώσεις (Persistent Mobile Organic Compounds, PMOCs) θα πρέπει να χαρακτηριστούν ως "επικίνδυνες" σύμφωνα με τον CLP EC 1278/2008 συνεχίζονται. Ωστόσο, πρόσφατες αξιολογήσεις έχουν επανεξετάσει την καταλληλόλητα της επίμονης παρουσίας και κινητικότητας σύμφωνα με τον κανονισμό REACH ως μοναδικά κριτήρια, λαμβάνοντας υπόψη την πιθανότητα οι ουσίες να φτάσουν σε επιφανειακά ή υπόγεια ύδατα. Η απομόνωση και ο προσδιορισμός αυτών των ενώσεων αποτελεί μία μεγάλη πρόκληση για την επιστημονική κοινότητα. Το επίκεντρο της περιβαλλοντικής αναλυτικής χημείας έχει στραφεί στην ανάπτυξη νέων αξιόπιστων μεθόδων προκατεργασίας δείγματος. Τα τελευταία χρόνια, αναπτύχθηκαν αρκετές νέες τεχνικές που ελαχιστοποιούν ή εξαλείφουν τη χρήση οργανικών διαλυτών, μειώνουν το συνολικό χρόνο ανάλυσης, είναι πιο οικονομικές και απλές, ενώ παρουσιάζουν μεγάλη ευαισθησία και εκλεκτικότητα. Στη βάση αυτή, στην παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε η σύγκριση μεταξύ εμπορικά διαθέσιμων υλικών για τον αξιόπιστο προσδιορισμό (πιθανών) vPvM/PMT σε υδατικά δείγματα, μέσω της εκχύλισης στερεής φάσης (Solid Phase Extraction, SPE). Για την επίτευξη βέλτιστης απόδοσης, δοκιμάστηκαν διάφορα αναλυτικά πρωτόκολλα, τα οποία περιλάμβαναν την αξιολόγηση διαφορετικών μικροστηλών εκχύλισης, ποικίλων pH δειγμάτων και διάφορων διαλυτών για έκπλυση και έκλουση. Οι ανακτήσεις για τις εξεταζόμενες ενώσεις κυμάνθηκαν στα αποδεκτά όρια (70-120%). Η γραμμικότητα ήταν εξαιρετική σε όλες τις περιπτώσεις (r2>0,997). Η επικύρωση των πολυυπολειμματικών μεθόδων που αναπτύχθηκαν πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με την ισχύουσα ευρωπαϊκή νομοθεσία, όπως καθορίζεται στις οδηγίες 2002/657/ΕΚ και SANTE 11813/2017. Επιπλέον για την εκχύλιση των υδατικών δειγμάτων επιλέχθηκε μία ακόμα ευρύτατα διαδεδομένη τεχνική η εκχύλιση στερεάς φάσης σε διασπορά (dispersive Solid Phase Extraction, dSPE), όπου δοκιμάστηκαν υλικά από οργανομεταλλικές ενώσεις συναρμογής του σιδήρου εμπορικά και μη καθώς και υδρογέλες. Και τα δύο υλικά που δοκιμάστηκαν έδωσαν τις ικανοποιητικές ανακτήσεις. Επόμενο βήμα της διατριβής αποτέλεσε η επιλογή τουλάχιστον τριών αντιπροσωπευτικών vPvM/PMT ενώσεων από διαφορετικές χημικές κατηγορίες (κλιμπαζόλη, τιαμουλίνη, DOSS) προς φωτόλυση σε υδατικά εμβολιασμένα δείγματα με στόχο την κινητική μελέτη και την ταυτοποίηση της δομής των παραγόμενων προϊόντων μετασχηματισμού (transformation products, TPs). Στο πλαίσιο της ολιστικής περιβαλλοντικής προσέγγισης της μελέτης της τύχης των ΡΜ ενώσεων πραγματοποιήθηκε αναζήτηση των ενώσεων σε περιβαλλοντικά δείγματα. Ξεκινώντας με την κλιμπαζόλη, αναπτύχθηκε και βελτιστοποιήθηκε μία νέα ροή εργασίας για τον προσδιορισμό των TPs με δεδομένα από τη βιβλιογραφία για τη δημιουργία μίας βελτιωμένης βάσης δεδομένων HRMS για περιβαλλοντικές έρευνες στον υδρολογικό κύκλο. Συνολικά, ταυτοποιήθηκαν 28 TPs, από τα οποία τα 14 αναφέρονται για πρώτη φορά στην παρούσα διατριβή. Οι κύριες διαδρομές μετασχηματισμού της μητρικής ένωσης αφορούσαν τον ισομερισμός, την αποχλωρίωση, την υδροξυλίωση και τη διάσπαση του αιθέρα ή του δεσμού C-N. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ένας έλεγχος ταυτοποίησης των TPs σε λύματα, στραγγίσματα, επιφανειακά και υπόγεια ύδατα, αποκαλύπτοντας μέγιστη συγκέντρωση 350 ng/L της κλιμπαζόλης σε υπόγεια ύδατα. Χρησιμοποιήθηκαν επιπλέον, in silico και in vitro μέθοδοι για την αξιολόγηση της τοξικότητας, που έδειξαν ανησυχητική τοξικότητα τόσο για την κλιμπαζόλη, όσο και ορισμένων TPs γεγονός που επιβεβαιώνει την κατηγοριοποίηση της ένωσης ως ΡΜΤ. Ακολούθησε η μελέτη της τιαμουλίνης, για την οποία συνολικά ταυτοποιήθηκαν 32 TPs, από τα οποία τα 18 αναφέρονται για πρώτη φορά. Οι κύριες διαδρομές μετασχηματισμού περιλαμβάνουν υδροξυλίωση, οξείδωση, αποαλκυλίωση και διάσπαση του δεσμού C-O. Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε εκτενής παρακολούθηση της τιαμουλίνης και των TPs της σε διάφορα περιβαλλοντικά διαμερίσματα, συμπεριλαμβανομένων δειγμάτων από μονάδες εκτροφής ζώων, στραγγίσματα, επιφανειακά νερά και υπόγεια ύδατα. Η υψηλότερη συγκέντρωση της μητρικής ένωσης παρατηρήθηκε σε στερεά δείγματα από τη μονάδα εκτροφής ζώων, στα 2847 ng/g. Επίσης, πραγματοποιήθηκαν και σε αυτήν την περίπτωση τόσο in silico, όσο και in vitro μέθοδοι για την αξιολόγηση της τοξικότητας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η τιαμουλίνη και πολλά TPs παρουσιάζουν ανησυχητική τοξικότητα. Τέλος, για το DOSS (Docusate Sodium Salt), ταυτοποιήθηκαν συνολικά 34 TPs, από τα οποία τα 33 αναφέρονται για πρώτη φορά. Η υδροξυλίωση, η οξείδωση και η αποαλκυλίωση είναι οι κύριες διαδικασίες μετασχηματισμού του DOSS. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε και σε αυτήν την περίπτωση εκτενής παρακολούθηση του DOSS και των TPs του σε διάφορα περιβαλλοντικά διαμερίσματα, συμπεριλαμβανομένων δειγμάτων από μονάδες επεξεργασίας λυμάτων, στραγγίσματα, επιφανειακά νερά και υπόγεια ύδατα. Στα δείγματα υπόγειων υδάτων, η μέση συγκέντρωση του DOSS υπολογίστηκε στα 183 ng/L.Το τελικό βήμα της διατριβής ήταν η παρακολούθηση των (πιθανών) PMOCs σε διάφορα περιβαλλοντικά υποστρώματα. Αυτές οι ουσίες είναι γνωστές για την υψηλή τους συγγένεια με το νερό, την ανθεκτικότητα στην περιβαλλοντική υποβάθμιση και τις πιθανές δυσμενείς επιπτώσεις στην ανθρώπινη υγεία και το περιβάλλον, ιδιαίτερα όταν ταξινομούνται ως τοξικές. Κατά συνέπεια, πραγματοποιήθηκε μία τριετής μελέτη παρακολούθησης (2021−2023) σε Εγκαταστάσεις Επεξεργασίας Λυμάτων (ΕΕΛ),υπόγεια και επιφανειακά νερά στη Βόρεια Ελλάδα (Θεσσαλονίκη), χρησιμοποιώντας την τεχνολογία Φασματομετρίας Μάζας Υψηλής Διακριτικής Ικανό9τητας (HRMS) για την ανίχνευση (πιθανών) PMOCs. Ξεκινώντας από την μελέτη στις ΕΕΛ, Η διαδικασία παρακολούθησης βασίστηκε σε δύο βασικές προσεγγίσεις ανάλυσης HRMS: την στοχευμένη ανάλυση και την ανάλυση «ύποπτων» ενώσεων. Δημιουργήθηκε μία λίστα 2.500 διαφορετικών (πιθανών) PMOCs με βάση τη διαθέσιμη βιβλιογραφία. Από αυτές, 55 ταυτοποιήθηκαν μέσω της στοχευμένης ανάλυσης σε τουλάχιστον ένα αναλυθέν δείγμα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι αντιυπερτασικές ουσίες και οι β-αναστολείς ήταν μεταξύ των πιο συχνά ανιχνευόμενων κατηγοριών PMOCs κατά την περίοδο δειγματοληψίας. Συγκεκριμένα, η βαλσαρτάνη και η ιρβεσαρτάνη παρουσίασαν σημαντικές αυξήσεις στη συγκέντρωση, ξεπερνώντας τα 5000 ng/L σε δείγματα εισροών και τα 1000 ng/L σε δείγματα εξόδου από ΕΕΛ. Επιπλέον, η μελέτη ενισχύθηκε με την τεχνική ανάλυσης «ύποπτων» ενώσεων, ενσωματώνοντας πιθανές ουσίες από τη βιβλιογραφία για την ενίσχυση του προγράμματος παρακολούθησης. Ως αποτέλεσμα, η λίστα των ταυτοποιημένων ενώσεων εμπλουτίστηκε με 16 επιπλέον ενώσεις με ταυτοποίηση επιπέδου 2b κατά Schymanski. Όσον αφορά την παρουσία των (πιθανών) PMOCs στα επιφανειακά νερά μόνο με την τεχνική της στοχευμένης ανάλυσης, πραγματοποιήθηκε έρευνα σε 18 διαφορετικές λίμνες και στον ποταμό Αξιό. Ξεκινώντας, το Diuron, συχνά απαντόμενη ΡΜ ένωση ανιχνεύθηκε σε δύο από τις 18 λίμνες. Συγκεκριμένα, στην Αμβρακία λίμνη η μέγιστη συγκέντρωση του καταγράφηκε στα 19.2 ng/L. Η ένωση με την μεγαλύτερη καταγεγραμμένη συγκέντρωση ήταν το carbendazim με συχνότητα ανίχνευσης 39%. Όσον αφορά τις φαρμακευτικές ενώσεις, οι ανιχνεύσιμες συγκεντρώσεις ήταν σαφώς μικρότερες, αλλά με αρκετά μεγάλη συχνότητα ανίχνευσης. Ιδιαίτερη έμφαση πρέπει να δοθεί στην ένωση δικλοφενάκη, η συγκέντρωση της οποίας άγγιξε τα 144 ng/L στην λίμνη Τριχωνίδα. Σχετικά με τον Αξιό ποταμό, οι φαρμακευτικές ενώσεις που ανιχνεύθηκαν ανήκουν σε διάφορες φαρμακευτικές κατηγορίες. Δύο από τις βασικότερες ενώσεις που ανιχνεύθηκαν ήταν η βαλσαρτάνη και η λοσαρτάνη. Συγκεκριμένα, η βαλσαρτάνη ανιχνεύθηκε σε συγκέντρωση μεγαλύτερη από 1000 ng/L και σε συχνότητα ανίχνευσης που ξεπερνά το 60%. Εξίσου υψηλή ήταν και η συχνότητα ανίχνευσης του λοσαρτάν. Τέλος όσον αφορά τα υπόγεια νερά το σύνολο των ανιχνεύσιμων φυτοφαρμάκων δεν ξεπερνούσε τα 60 ng/L με εξαίρεση το fluometuron που ξεπέρασε σε ένα από τα αναλυώμενα δείγματα τα 180 ng/L. Όσον αφορά την ανίχνευση των φαρμακευτικών ενώσεων στα υπόγεια νερά, ιδιαίτερης σημασίας χρήζει η κλιμπαζόλη, η μέγιστη συγκέντρωση της οποίας ξεπέρασε τα 350 ng/L. Επίσης υψηλά επίπεδα συγκέντρωσης χωρίς όμως να ξεπερνά αυτά της κλιμπαζόλης, ανιχνεύθηκε η φλουκοναζόλη (50 ng/L). Η μελέτη ολοκληρώθηκε με την εκτίμηση των περιβαλλοντικών κινδύνων η οποία αποκάλυψε τη χρόνια τοξικότητα σε διάφορα τροφικά επίπεδα ενώσεις όπως το fluometuron, η καρβαμαζεπίνη και η δικλοφενάκη. Τα ευρήματα υπογραμμίζουν τους οικολογικούς κινδύνους που συνδέονται με τα αυξημένα επίπεδα PMOCs και τονίζουν την ανάγκη για συνεχή παρακολούθηση και ρυθμιστικά μέτρα για τον μετριασμό των πιθανών περιβαλλοντικών επιπτώσεων. Τέλος, η μελέτη συμβάλλει στην κατανόηση των πολύπλοκων αλληλεπιδράσεων μεταξύ περιβαλλοντικών παραγόντων, κατανάλωσης PMOCs και ρύπανσης του υδάτινου οικοσυστήματος.