Valorization of rice hull for the biotechnological production of natural phenolic antioxidants using microalgae

Abstract

The object of this work is to propose an alternative way of utilizing rice hull, an underexploited type of lignocellulosic biomass, aiming to produce valuable microalgae biomass rich in natural antioxidant phenolic compounds. This study offers a unique and fresh look into biomass valorization with microalgae towards the production of value-added products, that can help meet the ever-growing demand from cosmetics and food industry for products of natural origin. On the one hand, rice hull is rich in cellulose, hemicellulose and thus is an excellent candidate for the production of a nutrients-rich hydrolysate that can serve as an economic and sustainable microalgae feed. On the other hand, microalgae biomass is considered as one of the most valuable types of biomass, able to biosynthesize a wide variety of biochemicals with endless applications. To this end, microalgae derived natural phenolic extracts with potent antioxidant activity were the target product of this study. The basic steps of the studied fields in this work can be categorized in the following: firstly, study of rice hull hydrolysis, secondly, cultivation of microalgae in rice hull hydrolysate, thirdly, study of the production of phenolic compounds from microalgae and fourthly, study of biomass phenolic extraction techniques. In addition, valuable biosilica recovery from the spent rice hulls was also covered. Finally, a simple technoeconomic analysis took place in the end of the study, to help better understand the feasibility of such a project in real life at a greater scale. The first step of this study consists of the thermochemical hydrolysis of rice hull, in which various types of pretreatments were tested, in particular acid and alkaline pretreatments. Also, the effect of various hydrolytic parameters was tested, such as hydrolysis time, solids loading, acid dose, temperature, whereas the importance of mechanical pretreatment (particle size) was also highlighted. The outcome of this study was the obtainment of the optimum hydrolytic conditions which lead to the production of a sugars- and nitrogen-rich liquid hydrolysate suitable for use as microalgae growth medium. Next, a microalga strain suitable for phenolics production was selected among several ones, after their cultivation autotrophically under the same conditions. The selected microalga, Botryococcus braunii, was then grown in rice hull hydrolysate aiming to combine high biomass production with optimum phenolics accumulation intracellularly. Various series of cultures in heterotrophic and mixotrophic conditions were carried out to in order to understand the mechanism which favors the production of phenolics of this microalga. What is more, a two-stage cultivation scheme was also tested in which B. braunii was grown first mixotrophically or heterotrophically in rice hull hydrolysate and secondly autotrophically, as a means to further improve its phenolics yields. On top of this, further studies on the autotrophic stage of the two-stage culture were done, with the goal to find adequate culture parameters that can enhance the total phenolic content of the produced biomass. From the above study, the optimum cultivation conditions leading to high phenolics accumulation were selected. Furthermore, the extraction of phenolics from microalgae biomass was also greatly investigated during this study. In particular, several solvents and extraction techniques were tested and compared towards their efficiency to effectively extract phenolic compounds, whereas both qualitative and quantitative methods were used for the evaluation of the obtained extracts. Finally, the technoeconomic assessment of the proposed process included the design of a complete flowchart for the entire process, the estimation of the total capital costs for each equipment type, the estimation of the total operational costs on a year-round basis, and an investment plan to calculate the revenues and return of investment in a hypothetic scenario that was selected for analysis. The conclusion of this study is that a multitude of important results were obtained in all the re-search fields studied, while innovative elements were added in the global effort to implement technologies that adhere to the principles of circular economy. The assessment of this specific study is that the combination of lignocellulosic biomass with microalgae cultivation is not only feasible, but a new technology that opens new avenues for the creation of complex biorefineries of lignocellulosic biomass with microalgae, which will in the future be able to combine the production of energy and value-added products with the utilization of these unexploited but valuable natural resources.

Το αντικείμενο αυτής της εργασίας είναι η πρόταση ενός εναλλακτικού τρόπου αξιοποίησης του φλοιού ρυζιού, ενός ανεκμετάλλευτου τύπου λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας, με στόχο την παραγωγή πολύτιμης βιομάζας μικροφυκών πλούσια σε φυσικές αντιοξειδωτικές φαινολικές ενώσεις. Το θέμα που παρουσιάζεται στην παρούσα μελέτη πρόκειται για μια ανανεωμένη ματιά στην αξιοποίηση της λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας με μικροφύκη προς την παραγωγή προϊόντων προστιθέμενης αξίας, που μπορούν να βοηθήσουν στην κάλυψη της συνεχώς αυξανόμενης ζήτησης από τη βιομηχανία καλλυντικών και τροφίμων για προϊόντα φυσικής προέλευσης. Από τη μία πλευρά, ο φλοιός ρυζιού είναι πλούσιος σε κυτταρίνη και ημικυτταρίνη και επομένως αποτελεί μια εξαιρετική πηγή για την παραγωγή ενός πλούσιου σε θρεπτικά συστατικά υδρολύματος, το οποίο μπορεί να χρησιμεύσει ως οικονομικό και βιώσιμο μέσο ανάπτυξης μικροφυκών. Από την άλλη πλευρά, η βιομάζα των μικροφυκών θεωρείται ως ένας από τους πιο πολύτιμους τύπους βιομάζας, που διαθέτει την μοναδική ιδιότητα να βιοσυνθέτει μια μεγάλη ποικιλία βιοχημικών ουσιών με ατελείωτες βιοτεχνολογικές εφαρμογές. Ως εκ τούτου, τα φυσικά φαινολικά εκχυλίσματα που προέρχονται από μικροφύκη με ισχυρή αντιοξειδωτική δράση επιλέχθηκαν ως το προϊόν-στόχος αυτής της μελέτης. Τα βασικά βήματα των πεδίων που μελετήθηκαν σε αυτή την εργασία μπορούν να κατηγοριοποιηθούν στα εξής: πρώτον, μελέτη της υδρόλυσης του φλοιού ρυζιού, δεύτερον, καλλιέργεια μικροφυκών σε υδρόλυμα φλοιού ρυζιού, τρίτον, μελέτη της παραγωγής φαινολικών ενώσεων από μικροφύκη και τέταρτον, μελέτη τεχνικών εκχύλισης φαινολικών ενώσεων από τη βιομάζα μικροφυκών. Επιπλέον, μελετήθηκε και η ανάκτηση του πολύτιμου βιοπυριτίου από τον χρησιμοποιημένο φλοιό ρυζιού, ως ένα ακόμα προϊόν προστιθέμενης αξίας της συγκεκριμένης διεργασίας. Τέλος, πραγματοποιήθηκε μια απλή τεχνοοικονομική ανάλυση βασισμένη στα πειραματικά αποτελέσματα που προέκυψαν από όλα τα στάδια της παραπάνω ανάλυσης, ώστε να γίνει πιο εύκολα κατανοητό ποια θα ήταν η βιωσιμότητα ενός τέτοιου έργου στην πραγματική ζωή σε μεγαλύτερη κλίμακα. Ειδικότερα, το πρώτο βήμα αυτής της μελέτης αποτελεί η θερμοχημική υδρόλυση του φλοιού ρυζιού, στην οποία δοκιμάστηκαν διάφορες μέθοδοι φυσικοχημικής προεπεξεργασίας, όπως η όξινη και η αλκαλική υδρόλυση. Επίσης, μελετήθηκαν διάφορες υδρολυτικές παράμετροι, όπως ο χρόνος υδρόλυσης, η συγκέντρωση του οξέος ή της βάσης, η θερμοκρασία και η φόρτιση σε στερεά. Επιπρόσθετα, στην παραπάνω μελέτη υπογραμμίστηκε και η σημασία της μηχανικής προεπεξεργασίας (μέγεθος κόκκων) της βιομάζας κατά την υδρόλυσή της. Το αποτέλεσμα όλων των παραπάνω ήταν η εύρεση των βέλτιστων υδρολυτικών συνθηκών, οι οποίες οδηγούν στην παραγωγή ενός υγρού υδρολύματος πλούσιου σε σάκχαρα και άζωτο κατάλληλο για χρήση ως μέσο ανάπτυξης μικροφυκών. Στη συνέχεια, διάφορα στελέχη μικροφυκών καλλιεργήθηκαν υπό αυτότροφες συνθήκες με στόχο την επιλογή ενός στελέχους κατάλληλου για την παραγωγή φυσικών φαινολικών συστατικών. Το μικροφύκος Botryococcus braunii που επιλέχθηκε αναπτύχθηκε στη συνέχεια σε υδρόλυμα φλοιού ρυζιού με στόχο την ταυτόχρονη επίτευξη υψηλής παραγωγής βιομάζας με τη βέλτιστη συσσώρευση φαινολικών συστατικών ενδοκυτταρικά. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκαν διάφορες σειρές καλλιεργειών σε ετερότροφες και μιξότροφες συνθήκες ώστε να γίνει κατανοητός ο μηχανισμός που ευνοεί την παραγωγή φαινολικών ουσιών αυτού του μικροφύκους. Επιπλέον, δοκιμάστηκε επίσης μια καλλιέργεια δύο σταδίων, κατά την οποία το μικροφύκος B. braunii αναπτύχθηκε πρώτα μιξοτροφικά ή ετερότροφα σε υδρόλυμα φλοιού ρυζιού και δεύτερον αυτοτροφικά, με στόχο την περαιτέρω βελτίωση της παραγωγής φαινολικών ενώσεων. Επιπρόσθετα, έγιναν περαιτέρω μελέτες για το αυτότροφο στάδιο της καλλιέργειας δύο σταδίων, με στόχο την εύρεση κατάλληλων παραμέτρων καλλιέργειας που μπορούν να ενισχύσουν το συνολικό φαινολικό περιεχόμενο της παραγόμενης βιομάζας. Από τα παραπάνω προέκυψαν οι βέλτιστες συνθήκες καλλιέργειας του συγκεκριμένου μικροφύκους. Επιπλέον, η εκχύλιση φαινολικών ενώσεων από τη βιομάζα μικροφυκών διερευνήθηκε επίσης σε μεγάλο βαθμό κατά τη διάρκεια της παρούσας μελέτης. Συγκεκριμένα, διάφοροι διαλύτες/τεχνικές εκχύλισης δοκιμάστηκαν και συγκρίθηκαν ως προς την αποτελεσματικότητά τους στην εκχύλιση φαινολικών ενώσεων, ενώ χρησιμοποιήθηκαν τόσο ποιοτικές όσο και ποσοτικές μέθοδοι για την αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής δράσης των ληφθέντων εκχυλισμάτων. Τέλος, η τεχνοοικονομική αξιολόγηση της προτεινόμενης διαδικασίας περιλάμβανε τον σχεδιασμό ενός πλήρους διαγράμματος ροής για όλη τη διαδικασία, την εκτίμηση του συνολικού κεφαλαιακού κόστους για κάθε τύπο εξοπλισμού, την εκτίμηση του συνολικού λειτουργικού κόστους σε ετήσια βάση και ένα επενδυτικό σχέδιο για τον υπολογισμό των εσόδων και της απόδοσης της επένδυσης σε ένα υποθετικό σενάριο που επιλέχθηκε για ανάλυση. Από την παρούσα μελέτη προέκυψε πληθώρα σημαντικών αποτελεσμάτων σε όλα τα ερευνητικά πεδία που μελετήθηκαν, ενώ προστέθηκαν καινοτόμα στοιχεία στην παγκόσμια προσπάθεια για την εφαρμογή τεχνολογιών που αφουγκράζονται τις αρχές της κυκλικής οικονομίας. Η αποτίμηση της συγκεκριμένης μελέτης είναι ότι ο συνδυασμός της λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας με την καλλιέργεια μικροφυκών είναι όχι απλά εφικτός, αλλά μια νέα τεχνολογία που ανοίγει νέους δρόμους για την δημιουργία σύνθετων βιοδιυλιστηρίων λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας με μικροφύκη, τα οποία θα μπορούν μελλοντικά να συνδυάζουν την παραγωγή ενέργειας και προϊόντων προστιθέμενης αξίας με την αξιοποίηση αυτών των τόσο ανεκμετάλλευτων αλλά και πολύτιμων φυσικών πόρων.