Πειραματικά μοντέλα αποφρακτικών νοσημάτων πνεύμονα

Abstract

Introduction: Resistive breathing (RB) is a key feature of obstructive lung diseases, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and results in increased mechanical stress on the lung, especially during exacerbations. The effect of resistive breathing on the lungs of previously healthy animals has been previously studied and has been shown to cause damage and inflammation. Cigarette smoke (CS) exposure is a major cause of COPD, and the elastase exposure model is widely used as a COPD model. We hypothesized that resistive breathing exerts additive effects when combined with either cigarette smoke or elastase exposure, simulating an acute COPD exacerbation. Methodology: Regarding cigarette smoke exposure, experimental animals (C57BL/6 mice) were exposed to smoke from five (5) reference cigarettes, four (4) times a day, five (5) days a week for one (1) and six (6) months (subacute and chronic exposure, respectively), while the control group was exposed to room air. In the elastase exposure model, intratracheal injection of porcine pancreatic elastase was performed and then they returned to the holding area for twenty-one (21) days. The control group was instilled with saline. At the end of each time point, the mice were subjected to resistive breathing (RB) for 24 hours with tracheal banding (TB) while the control group underwent sham surgery. After 24 hours of RB, respiratory mechanics were measured, bronchoalveolar lavage (BAL) was performed for cell counts, and histological analysis was performed on lung tissue sections, specifically, the presence of acute lung inflammation and injury and the presence of pulmonary emphysema was assessed. In addition, surfactant protein D (SP-D) was measured in blood and BAL fluid (BALF) samples, while cytokine levels were measured in lung tissue samples by ELISA. Results: Cigarette smoke exposure was associated with increased cellularity in BAL (~7-fold in subacute and ~2-fold in chronic exposure compared to the control group, p<0.001). The addition of RB resulted in further cell increase at both time points, while a further increase in MCP-1 cytokine levels was noted at 1 month. Regarding mechanics, exposure to cigarette smoke increased resistance while the addition of resistive breathing was associated with reduced compliance at both one (1) and six (6) months of exposure. In histology, an increase in both lung inflammation and injury scores was observed during subacute exposure, while at six (6) months it was initially confirmed that chronic exposure to cigarette smoke results in the development of emphysema and that this is exacerbated by the combination with resistive breathing (p≤0.001). Finally, cigarette smoke exposure was associated with increased levels of SP-D in BALF (~2-fold compared to ctrl, p<0.001), while RB induced increased levels in blood in both groups (2-fold compared to ctrl and 2.5-fold with CS, p<0.001).Regarding the elastase exposure model, after 21 days of elastase exposure, the addition of resistive breathing induced neutrophilia in BAL. Elastase exposure induced an increase in compliance (p<0.001), but the combination with resistive breathing reduced it, compared to elastase exposure alone (p=0.006). From the histological analysis, emphysema development was observed as recorded by both scores after elastase exposure, (p≤0.003), while resistive breathing for 24 hours did not further aggravate it. Conclusion: The combination of resistive breathing with cigarette smoke exposure and elastase leads to increased inflammatory responses.

Εισαγωγή: Η αναπνοή μέσα από αντιστάσεις [εργώδης αναπνοή - resistive breathing (RB)] αποτελεί βασικό χαρακτηριστικό των αποφρακτικών νοσημάτων του πνεύμονα, όπως η χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (ΧΑΠ), και έχει ως αποτέλεσμα αυξημένο μηχανικό στρες στον πνεύμονα, ειδικά κατά τη διάρκεια παρόξυνσης. Έχει ήδη μελετηθεί η επίδραση της εργώδους αναπνοής σε πνεύμονες προηγουμένως υγιών πειραματόζωων και έχει φανεί πως προκαλεί βλάβη και φλεγμονή. Η έκθεση στον καπνό του τσιγάρου (cigarette smoke - CS) αποτελεί κύρια αιτία της ΧΑΠ ενώ και το μοντέλο έκθεσης στην ελαστάση χρησιμοποιείται ευρέως ως μοντέλο ΧΑΠ. Υποθέσαμε λοιπόν ότι η εργώδης αναπνοή ασκεί αθροιστικά αποτελέσματα όταν συνδυάζεται με την έκθεση στον καπνό τσιγάρου ή την έκθεση στην ελαστάση, προσομοιάζοντας μια οξεία παρόξυνση ΧΑΠ. Μεθοδολογία: Όσον αφορά την έκθεση στον καπνό τσιγάρου, τα πειραματόζωα (μύες C57BL/6) εκτέθηκαν σε καπνό πέντε (5) τσιγάρων αναφοράς, τέσσερις (4) φορές την ημέρα, πέντε (5) ημέρες την εβδομάδα για έναν (1) και έξι (6) μήνες (υποξεία και χρόνια έκθεση αντίστοιχα), ενώ η ομάδα ελέγχου εκτέθηκε σε αέρα δωματίου. Στο μοντέλο έκθεσης στην ελαστάση, πραγματοποιήθηκε ενδοτραχειακή έγχυση χοίρειας παγκρεατικής ελαστάσης και στη συνέχεια επέστρεψαν στον χώρο φύλαξης για είκοσι μία (21) ημέρες. Στην ομάδα ελέγχου έγινε ενστάλαξη φυσιολογικού ορού. Στο τέλος του κάθε χρονικού σημείου οι μύες υποβλήθηκαν σε εργώδη αναπνοή (RB) για 24 ώρες με περίδεση της τραχείας (tracheal banding - TB) ενώ το control group υποβλήθηκε σε εικονική επέμβαση. Μετά από 24 ώρες RB, μετρήθηκε η μηχανική του αναπνευστικού συστήματος, πραγματοποιήθηκε βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL) για καταμέτρηση κυττάρων, έγινε ιστολογική ανάλυση σε τομές πνευμονικού ιστού, ειδικότερα, αξιολογήθηκε η παρουσία οξείας πνευμονικής φλεγμονής και τραυματισμού και η παρουσία πνευμονικού εμφυσήματος. Επιπλέον, η επιφανειοδραστική πρωτεΐνη D (SP-D) μετρήθηκε σε δείγματα αίματος και υγρού BAL (BALF), ενώ σε δείγματα ιστού πνεύμονα μετρήθηκαν τα επίπεδα κυτταροκινών με ELISA.Αποτελέσματα: Η έκθεση στον καπνό τσιγάρου συσχετίστηκε με αυξημένη κυτταρικότητα στο BAL (~7 φορές στην υποξεία και ~2 φορές στη χρόνια έκθεση σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, p<0,001). Η προσθήκη της RB είχε ως παοτέλεσμα την περαιτέρω αύξηση των κυττάρων και στα δύο χρονικά σημεία, ενώ σημειώθηκε περαιτέρω αύξηση στα επίπεδα της κυτοκίνης MCP-1 στον 1 μήνα. Όσον αφορά την μηχανική, η έκθεση στον καπνό τσιγάρου αύξησε τις αντιστάσεις ενώ η προσθήκη της εργώδους αναπνοής συσχετίστηκε με μειωμένη ενδοτικότητα τόσο στον έναν (1) όσο και στους έξι (6) μήνες έκθεσης. Στην ιστολογία, παρατηρήθηκε αύξηση και στις δύο βαθμολογίες πνευμονικής φλεγμονής και τραυματισμού κατά την υποξεία έκθεση, ενώ στους έξι (6) μήνες επιβεβαιώθηκε αρχικά ότι η χρόνια έκθεση στον καπνό τσιγάρου έχει ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη εμφυσήματος και ότι αυτό επιδεινώνεται από το συνδυασμό με την εργώδη αναπνοή (p≤0,001). Τέλος, η έκθεση στον καπνό τσιγάρου συσχετίστηκε με αυξημένα επίπεδα SP-D στο BALF (~2 φορές σε σχέση με ctrl, p<0,001), ενώ η RB προκάλεσε αυξημένα επίπεδα στο αίμα και στις δύο ομάδες (2 φορές σε σύγκριση με τα ctrl και 2,5 φορές με CS , p<0,001). Όσον αφορά το μοντέλο έκθεσης στην ελαστάση, μετά από 21 ημέρες έκθεσης στην ελαστάση, η προσθήκη της εργώδους αναπνοής προκάλεσε ουδετεροφιλία στο BAL. Η έκθεση στην ελαστάση προκάλεσε αύξηση της ενδοτικότητας (p<0,001), αλλά ο συνδυασμός με την εργώδη αναπνοή τη μείωσε, σε σύγκριση με την έκθεση στην ελαστάση μόνο (p=0,006). Από την ιστολογική ανάλυση, παρατηρήθηκε ανάπτυξη εμφυσήματος όπως αυτό καταγράφηκε από τις δύο βαθμολογίες μετά την έκθεση στην ελαστάση, (p≤0,003), ενώ η εργώδης αναπνοή για 24 ώρες δεν το επιδείνωσε περαιτέρω. Συμπέρασμα: Ο συνδυασμός της εργώδους αναπνοής με την έκθεση στον καπνό του τσιγάρου και την ελαστάση οδηγεί σε αυξημένες φλεγμονώδεις αποκρίσεις.