Functional role of the RasGAP Neurofibromin isoforms in central nervous system cells

Abstract

Neurofibromin, the protein encoded by the NF1 gene, is known for its role as the primary RasGAP in the central nervous system (CNS), and as a protein associated with both the cytoskeleton and the cell nucleus. Inherited or de novo NF1 mutations (>3000 recognized to date) cause Neurofibromatosis Type 1 (NF-1), a disease characterized by a broad spectrum of clinical symptoms in the CNS, ranging from learning disabilities to 5-fold increased risk of glioblastoma. The confirmation of a causative mutation through molecular diagnosis does not provide insights into prognosis or treatment, as the correlations between genotype and phenotype remain limited. Part of the reason for these weak correlations are alternative splicing events, such as of exons 31 and 51, that lead to the expression of four different isoforms with potentially distinct cellular roles, which remain poorly elucidated. In particular, alternative splicing of exon 51, which includes a nuclear localization sequence (NLS) may generate two isoform types: NLS that express the NLS sequence and can enter the nucleus via Ran, and ΔNLS that lack any nuclear-cytoplasmic trafficking capacity. This study focuses on investigating the functions of NLS and ΔNLS neurofibromin isoforms. To study the functional differences between the two isoform types, we genetically modified SF268 glioblastoma cell lines with appropriate shRNAs that allow the expression of either NLS or ΔNLS neurofibromin isoforms, or maintain the physiological NLS:ΔNLS ratio through the expression of a scrambled shRNA. We first investigated using immunocytochemistry, coupled to quantification and statistical analysis of confocal microscopy data, whether the previous shown colocalization of neurofibromin with tubulins reflects its function as a Microtubule-Associated Protein (MAP), and further, whether the NLS and ΔNLS isoforms are different MAPs. Our findings demonstrate that a. both types of isoforms are indeed distinct MAPs, as they produce statistically significant effects on microtubule nucleation, bundling, and branching (both for cytoplasmic and mitotic microtubules), b. in addition to α- and β-tubulin co-localization, they also bind to γ-tubulin, differentially affecting the size of the centrosome, microtubule nucleation at the centrosome, and its relative position to the nucleus, particularly during cell migration, and c. their varying functions as MAPs are evidenced by the significantly altered geometry of asters and mitotic spindles, especially in ΔNLS-SF268 cells where chromosome segregation is significantly disrupted and leads to increased frequency of micronuclei. Our data also reveal that the two isoforms of neurofibromin display discrete capacities as RasGAPs. By analyzing the temporal activation of H-Ras within the intracellular signalling pathway of the cannabinoid receptor 1 (CB1R), we show that ΔNLS isoforms possess greater RasGAP activity compared to the NLS ones. Specifically, the activation of H-Ras peaks at a later time but is maintained for a longer period in comparison to cells expressing NLS isoforms or both types. Moreover, our analysis of the translocation of H-Ras molecules from lipid rafts to less-ordered membrane regions (by detecting of H-Ras in cellular membrane subfractions) reveals that ΔNLS isoforms strongly facilitate the movement of H-Ras molecules away from the lipid rafts, thereby exhibiting an enhanced capacity to regulate Ras activation. Furthermore, our quantitative analysis of ΔNLS transcript expression through RT-qPCR shows significant increases during the differentiation of early post-mitotic chick embryo cortical neurons, both in tissue and in culture. Consequently, we designed specific Splice-Switching Oligonucleotides (SSOs) to induce exon 51 skipping; after exposure to these SSOs of freshly plated primary neurons in culture for 3 or more days, we attained reversal of the NLS:ΔNLS ratio at the onset of neuronal differentiation. Thus, we demonstrate that such perturbation a. results in the dynamic activation of H-Ras molecules upon CB1R stimulation, forcing a “treadmilling” pattern of H-Ras movement out-and-in the lipid rafts, thereby confirming ΔNLS isoforms as more potent RasGAPs than the NLS ones, as evidenced in ΔNLS-SF268 cells, b. causes a delay in the transcriptional program governing neuronal differentiation, and imposes changes in the expression of regulatory and transcription factors related with cytoskeleton function (as shown with RNA sequencing analysis) and c. disrupts actin polymerization, causing increased collateral branching, increased neurite length with reduced diameter, and reduced growth cone volume, as demonstrated by the quantification and statistical analysis of these parameters from multiphoton confocal microscopy data. Additionally, through proteomic analysis of immunoprecipitates, we demonstrate that each isoform exhibits unique protein-protein interactions with regulatory proteins involved in the Rho–ROCK–myosin II pathway, thereby offering additional evidence of their contrasting roles in cytoskeletal contractility. Importantly, our pharmacological interventions targeting actomyosin organization reveal a compartmentalized function of the ΔNLS and NLS neurofibromin isoforms within neurites and growth cones. The results of this research significantly enhance our understanding of the multifunctional neurofibromin protein, providing novel insights into the mechanisms of action of neurofibromin isoforms, which may facilitate the development of genotype-phenotype correlations and prognostic indicators for NF-1.

Η νευροϊνιδίνη, η πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το γονίδιο NF1, θεωρείται ως η κύρια RasGAP του νευρικού συστήματος, δηλαδή ως αρνητικός ρυθμιστής του μοριακού διακόπτη Ras, αλλά και ως πρωτεΐνη που σχετίζεται με τον κυτταροσκελετό και με τον πυρήνα του κυττάρου. Κληρονομούμενες ή de novo μεταλλάξεις του NF1 προκαλούν τη νόσο Νευροϊνωμάτωση τύπου 1 (NF-1), νόσο με ποικίλα κλινικά συμπτώματα κυρίως στο ΚΝΣ που δύναται να κυμαίνονται από μαθησιακές δυσκολίες έως υψηλή προδιάθεση για ανάπτυξη γλοιοβλαστώματος, χωρίς ωστόσο σαφή συσχέτιση μεταξύ γονοτύπου και φαινοτύπου και άρα δυσκολίες στην πρόγνωση της εξέλιξης της νόσου βάσει της μοριακής διάγνωσης. Η δυσκολία αυτή επιτείνεται και από το εναλλακτικό μάτισμα των εξονίων 31 και 51, που οδηγεί στην έκφραση ισομορφών με πιθανά διακριτούς κυτταρικούς ρόλους. Η παρούσα μελέτη επικεντρώνεται στην έρευνα των διακριτών λειτουργιών των ισομορφών που προέρχονται από το εναλλακτικό μάτισμα του εξονίου 51. Δεδομένου ότι το εξόνιο 51 εμπεριέχει αλληλουχία πυρηνικού εντοπισμού (Nuclear Localization Sequence, NLS), η εναλλακτική έκφραση του δημιουργεί δύο βασικές ισομορφές: τις NLS, που εκφράζουν την αλληλουχία NLS και δύνανται να εισέλθουν στον πυρήνα μέσω της Ran, και τις ΔNLS, που στερούνται τη δυνατότητα πυρηνο-κυτταροπλασματικής διακίνησης. Για τη μελέτη των λειτουργικών διαφορών των δύο τύπων ισομορφών, δημιουργήσαμε γενετικά τροποποιημένες σειρές κυττάρων γλοιοβλαστώματος SF268 με κατάλληλα shRNAs, ώστε να εκφράζουν είτε NLS είτε ΔNLS ισομορφές νευροϊνιδίνης ή να διατηρούν τη φυσιολογική αναλογία NLS:ΔNLS λόγω έκφρασης shRNA-μάρτυρα ελέγχου. Σε αυτές τις σειρές πρώτα διερευνήσαμε αν ο συνεντοπισμός της νευροϊνιδίνης με τους μικροσωληνίσκους οφείλεται στην ικανότητα του μορίου να δρά ως πρωτεΐνη που συνδέεται με μικροσωληνίσκους (Microtubule Associated Protein, MAP) και περαιτέρω αν οι NLS διαφέρουν από τις ΔNLS ισομορφές ως MAPs (με μεθόδους ανοσοκυτταροχημείας, και ποσοτικοποίησης-στατιστικής ανάλυσης δεδομένων συνεστιακής μικροσκοπίας). Αποδείξαμε ότι: α. και οι δύο τύποι ισομορφών είναι MAPs, καθώς παράγουν διακριτά και στατιστικά σηματικά αποτελέσματα στην πυρήνωση, δέσμωση και τη διακλάδωση των μικροσωληνίσκων τόσο του κυτταροπλάσματος όσο και της μιτωτικής ατράκτου β. εκτός της συγγένειας για α- και β-τουμπουλίνες, παρουσιάζουν συγγένεια και με τη γ-τουμπουλίνη, επηρεάζοντας με διαφορετικό τρόπο το μέγεθος του κεντροσώματος, την πυρήνωση των μικροσωληνίσκων σε αυτά, αλλά και τη σχετική του θέση ως προς τον πυρήνα, ειδικά κατά την κυτταρική μετανάστευση γ. η διαφορετική λειτουργία των ισομορφών ως MAPs αποδεικνύεται κυρίως από την εξαιρετικά αλλοιωμένη γεωμετρία που προκαλούν, ειδικά οι ΔNLS ισομορφές, στους αστέρες και τη μιτωτική άτρακτο, που με τη σειρά της προκαλεί απορρύθμιση στον διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων και στην αυξημένη συχνότητα μικροπυρηνίσκων και ανευπλοειδίας. Η μελέτη αποκάλυψε επίσης ότι οι δύο ισομορφές της νευροϊνιδίνης παρουσιάζουν διακριτή λειτουργία στο ρόλο τους ως RasGAPs. Αναλύοντας την ενεργοποίηση της H-Ras στο μονοπάτι ενδοκυττάριας σηματοδότησης του κανναβινοειδούς υποδοχέα 1 (cannabinoid receptor 1, CB1R), δείξαμε ότι οι ΔNLS-ισομορφές έχουν ισχυρότερη RasGAP δραστικότητα, δηλαδή, η ενεργοποίηση κορυφώνεται αργότερα, αλλά διαρκεί περισσότερο, σε σύγκριση με τα κύτταρα που εκφράζουν NLS ισομορφές ή και τις δύο. Επιπλέον, η ανάλυση της μετακίνησης των μορίων H-Ras από τις λιπιδικές σχεδίες προς τις λιγότερο διατεταγμένες περιοχές της μεμβράνης (ανίχνευση H-Ras σε κλάσματα κυτταρικών μεμβρανών) αποκάλυψε ότι οι ΔNLS προωθούν έντονα τη μετανάστευση μορίων H-Ras προς μετάδοση του μηνύματος ενδοκυττάρια και συνεπώς έχουν αυξημένη ικανότητα ελέγχου της ενεργοποίησης Ras. Ποσοτική ανάλυση της έκφρασης του ΔNLS μεταγράφου με RT-qPCR έδειξε ότι αυτή αυξάνεται με τη διαφοροποίηση των νευρώνων του φλοιού (έμβρυο όρνιθας) είτε στον ιστό είτε στην καλλέργεια, οπότε σχεδιάσαμε ειδικά αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια (splice-switching oligonucleotides, SSOs) που επάγουν την παράλειψη του εξονίου 51, με στόχο την αναστροφή του λόγου έκφρασης NLS:ΔNLS ισομορφών άμα την έναρξη της νευρωνικής διαφοροποίησης στην καλλιέργεια. Η αναστροφή αυτή σε πρωτογενείς νευρώνες α. οδηγεί, μετά από διέργεση του CB1R, σε δυναμική ενεργοποίησή της H-Ras αλλά και σε δραστική ανατροφοδότηση της στις λιπιδικές σχεδίες, επιβεβαιώνοντας το ρόλο των ΔNLS ισομορφών ως δραστικότερων RasGΑPs όπως διαπιστώσαμε και στα ΔNLS-SF268 κύτταρα, β. προκαλεί καθυστέρηση στο μεταγραφικό πρόγραμμα νευρωνικής διαφοροποίησης και αλλαγές στην έκφραση ρυθμιστικών και μεταγραφικών παραγόντων που σχετίζονται με τη λειτουργία του κυτταροσκελετού (ανάλυση RNA-sequencing) και γ. διαταράσσει την ικανότητα πολυμερισμού της ακτίνης, οδηγώντας σε αύξηση των πλευρικών διακλαδώσεων, του μήκους των νευριτών και μείωση της διάμετρου τους, καθώς και μείωση του όγκου των αυξητικών κώνων, όπως αποδεικνύει η ποσοτικοποίηση και στατιστική ανάλυση αυτών των παραμέτρων επί δεδομένων πολυφωτονικής συνεστιακής μικροσκοπίας. Επιπλέον, με αναλύσεις πρωτεωμικής εντοπίσαμε ειδικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ κάθε ισομορφής με ρυθμιστικές πρωτεϊνες του μονοπατιού Rho–ROCK–μυοσίνης II, αποδεικνύοντας περαιτέρω τον αντίθετο ρόλο των ισομορφών στη συσταλτικότητα του κυτταροσκελετού. Αξιοσημείωτα, φαρμακολογικές επεμβάσεις στη διάταξη της ακτομυοσίνης τεκμηρίωσαν τη χωρική εξειδίκευση των ΔNLS και NLS ισομορφών της νευροϊνιδίνης στους νευρίτες και τους αυξητικούς κώνους. Τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας διευρύνουν σημαντικά τη γνώση μας για τις πολλαπλές λειτουργίες της νευροϊνιδίνης και παρέχουν νέες πληροφορίες για τους μηχανισμούς δράσης των ισομορφών της, οι οποίες μπορούν να συμβάλουν μελλοντικά στη συσχέτιση γονοτύπου-φαινοτύπου και την ανάπτυξη προγνωστικών δεικτών για τη NF-1.