Σύγχρονες μέθοδοι ολοκληρωμένης διαχείρισης ωχρατοξινών στην καλλιέργεια της αμπέλου: -: -

Abstract

The aim of the present study was to collect and analyze data in order to develop an integrated management strategy for controlling sour rot and ochratoxin A (OTA) contamination in grapevine cultivation. This strategy combines biological and chemical approaches to mitigate ochratoxigenic fungi.One of the most significant threats to food safety and quality is mycotoxins that are highly toxic, carcinogenic, low-molecular-weight metabolites produced by certain fungal species. Hundreds of mycotoxins with diverse chemical structures have been identified. Globally, food losses due to mycotoxin contamination and associated management costs are reaching alarming levels. Notably, over 80% of crops worldwide are contaminated with mycotoxins annually (Streit et al., 2013; Kovalsky et al., 2016). Many mycotoxins are extremely stable and persist even after food processing. Their presence in animal feed can also lead to their transfer into animal-derived products intended for human consumption, posing severe health risks including death, particularly in developing countries. Reliable solutions for mycotoxin mitigation remain scarce and often impractical. Given the European Union’s strict regulations on mycotoxin levels in food products, finding effective and sustainable solutions is imperative. Cost-effective approaches involve leveraging agricultural technology and knowledge to prevent fungal colonization and inhibit mycotoxin production through integrated, environmentally friendly management systems.Among the carcinogenic mycotoxins becoming a significant concern in Greece are ochratoxins, primarily produced by fungi from the genera Aspergillus and Penicillium. Specifically, Aspergillus carbonarius is a major plant pathogen affecting grapevine cultivation, contributing to sour rot in grapes and serving as the primary producer of ochratoxin A (OTA). This toxin compromises the organoleptic properties of wine and threatens consumer safety. OTA exhibits nephrotoxic, hepatotoxic, and carcinogenic effects (classified as Group 2B by the IARC) in both animals and humans. Samples from grapes and grape-derived products—such as raisins, grape juice, and wine—in southern Europe frequently show OTA contamination at significantly higher levels than those from northern Europe. Initial estimates by the Codex Alimentarius Commission, based on limited European data, suggest that red wine is the second-largest source of human OTA exposure after cereals, followed by coffee and beer.This study investigated the ecology of Aspergillus section Nigri fungi in vineyards and evaluated modern integrated management practices, including chemical, biological, and molecular-genetic strategies for controlling mycotoxigenic fungi. Such a comprehensive study has never been conducted in Greece before and is expected to significantly advance research on this major grapevine disease, both nationally and internationally. Additionally, it will help reduce consumer exposure to high ochratoxin levels while promoting the production of safe, high-quality grapes, raisins, and wines.To assess population variability and identify endemic strains of Aspergillus section Nigri in Greek vineyards, grape sampling was conducted from 2015 to 2019. A collection of 260 Aspergillus section Nigri strains was established. Molecular identification confirmed the presence of both biseriate and uniseriate black aspergilli, consistent with previous studies. Phylogenetic analysis based on the β-tubulin gene locus classified the Greek isolates into two groups: the biseriate aspergilli (dominated by A. carbonarius, 97.6% of isolates) and the uniseriate group (comprising A. uvarum). The OTA-producing capacity of selected A. carbonarius and fumonisin-producing potential of A. niger isolates were also examined. All A. carbonarius isolates were highly ochratoxigenic, with OTA levels ranging from 136 ppb to 7139 ppb—consistent with findings from other warm regions (Belli et al., 2005; Pietri et al., 2001; Sage et al., 2004; Serra et al., 2003; Battilani et al., 2006; Chiotta et al., 2013). The highest OTA-producing strains were from the Peloponnese and Attica regions. Additionally, all 20 A. niger isolates tested produced fumonisins, albeit mostly at low levels.An in vitro evaluation assessed the resistance/tolerance of 21 grapevine cultivars (Agianniotiko, Agiorgitiko, Athiri, Assyrtiko, Avgoustiatis, Georgiana, Kydonitsa, Lagorthi, Limnio, Malagousia, Mandilaria, Mavrodaphne, Debina, Xinomavro, Pavlos, Razaki, Roditis, Savatiano, Sideritis, Stafida, and Fraoula) to Aspergillus carbonarius and OTA contamination. Significant variability was observed between cultivars across experimental years. In 2018, the most resistant cultivar was Fraoula, while Pavlos was the most susceptible. In 2019, Roditis showed the highest resistance, whereas Debina and Sideritis were the most susceptible. Regarding OTA production, Roditis, Mavrodaphne, Athiri, Xinomavro, and Razaki exhibited concentrations below 10 ppb, indicating low susceptibility. In contrast, Kydonitsa, Lagorthi, Pavlos, and Avgoustiatis showed higher OTA levels (below 50 ppb).An effort was subsequently made to establish a collection of 140 yeast strains in order to identify potential biological control agents for integrated OTA management. The most effective strain in vitro was VOL3 (from the Plant Pathology Laboratory collection, isolated from grapevine leaves), which inhibited conidia formation by 99%. In situ experiments identified 28 yeast isolates that reduced OTA levels below the detection limit. Overall, 52.3% of isolates successfully reduced OTA production.An additional objective of the present study was to evaluate in vitro ten essential oils (EOs), cinnamon (Cinnamomum zeylanicum), thyme (Thymus vulgaris), mint (Mentha piperita), lavender (Lavandula angustifolia), marjoram (Origanum majorana), tea tree (Melaleuca alternifolia), rosemary (Rosmarinus officinalis), sage (Salvia sclarea), citronella (Cymbopogon nardus), and geranium (Pelargonium graveolens)—were for their effects on A. carbonarius growth, OTA production, and expression of the secondary metabolism regulatory gene AclaeA. Thyme, lavender, and rosemary were the most effective against strain 5010, while thyme was the most effective against strain Ac29—even at low concentrations. Cinnamon strongly inhibited fungal growth in both strains. Based on these findings, cinnamon, geranium, thyme, mint, rosemary, and citronella were further tested for their impact on AclaeA expression. Cinnamon, geranium, and thyme significantly suppressed AclaeA expression four days post-inoculation, suggesting a potential mechanism for OTA biosynthesis inhibition.Finally, an integrated management model combining biological and chemical strategies was developed to control sour rot and OTA in grapevine cultivation. Eight fungicide active ingredients were tested for their ability to inhibit mycelial growth in nine highly toxigenic A. carbonarius isolates, with resistance development also monitored. Field experiments (2016–2019) at the Agricultural University of Athens’ farm in Spata, Attica, assessed the efficacy of individual and combined chemical/biological treatments. The most effective treatment in reducing disease severity and OTA levels (2019) was a combination of Switch® (chemical), Scala® (chemical), Vacciplant®, Serenade®, and Trianum® (biological formulations). Implementing an Integrated Pest Management (IPM) system in grapevine cultivation will reduce synthetic fungicide use, minimize environmental harm, and enhance vineyard sustainability.

Σκοπός της παρούσας Διδακτορικής διατριβής είναι η συλλογή και επεξεργασία όλων εκείνων των χαρακτηριστικών έρευνας και τεχνολογίας ώστε να προκύψει μία στρατηγική ολοκληρωμένης διαχείρισης και αντιμετώπισης της όξινης σήψης και της ΟΤΑ στην καλλιέργεια της αμπέλου, με συνδυασμό βιολογικής και χημικής αντιμετώπισης των ωχρατοξικογόνων μυκήτων. Μια από τις μεγαλύτερες απειλές για την ασφάλεια και την ποιότητα των τροφίμων είναι οι μυκοτοξίνες, ιδιαίτερα τοξικοί και καρκινογόνοι μεταβολίτες χαμηλού μοριακού βάρους που παράγονται από ορισμένα είδη μυκήτων. Έχουν εντοπιστεί εκατοντάδες είδη μυκοτοξινών, που διαφέρουν από χημική άποψη. Οι απώλειες τροφίμων που οφείλονται σε επιμόλυνση από μυκοτοξίνες και οι δαπάνες της διαχείρισής τους αυξάνονται σε ανησυχητικό επίπεδο παγκοσμίως. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι πάνω από το 80% των καλλιεργειών μολύνονται με μυκοτοξίνες σε παγκόσμιο επίπεδο σε ετήσια βάση (Streit et al., 2013; Kovalsky et al., 2016). Πολλές από τις μυκοτοξίνες είναι εξαιρετικά σταθερές και δεν εξουδετερώνονται ακόμα και μετά την επεξεργασία του προϊόντος. Ομοίως, η παρουσία τους στις ζωοτροφές μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα τη μεταφορά τους και σε ζωικά προϊόντα που προορίζονται για κατανάλωση από τον άνθρωπο, γεγονός που μπορεί να έχει βλαβερές συνέπειες για την ανθρώπινη υγεία και να προκαλέσει μέχρι και θάνατο (παρατηρείται ιδιαίτερα στις αναπτυσσόμενες χώρες). Αξιόπιστες λύσεις για τον περιορισμό των μυκοτοξινών είναι ακόμα ελάχιστες και πρακτικά ανεφάρμοστες. Η νομοθεσία της Ευρωπαϊκής Ένωσης για την παρουσία των μυκοτοξινών σε διάφορα προϊόντα είναι πολύ αυστηρή και κάνει επιτακτική την ανεύρεση αποτελεσματικών λύσεων. Οι οικονομικά αποτελεσματικές λύσεις είναι εκείνες που με τη βοήθεια της γεωργικής τεχνολογίας και γνώσης θα συμβάλλουν στον αποκλεισμό των μυκήτων από το φυτό - ξενιστή ή/ και την παρεμπόδιση παραγωγής μυκοτοξινών στα φυτά - ξενιστές τους με τη βοήθεια ενός ολοκληρωμένου συστήματος διαχείρισης φιλικού προς το περιβάλλον. Ανάμεσα στις καρκινογόνες μυκοτοξίνες που αρχίζουν να αποτελούν σημαντικό πρόβλημα για την Ελλάδα είναι οι ωχρατοξίνες που παράγονται κυρίως από διάφορα είδη μυκήτων του γένους Aspergillus και Penicillium. Πιο συγκεκριμένα, ο μύκητας Aspergillus carbonarius είναι από τα σημαντικότερα φυτοπαθογόνα που προσβάλλουν την καλλιέργεια της αμπέλου, συμβάλλοντας στην ασθένεια της όξινης σήψης στα σταφύλια, και είναι ο κύριος υπεύθυνος για την παραγωγή της μυκοτοξίνης ωχρατοξίνης Α (ΟΤΑ) επηρεάζοντας αρνητικά τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του κρασιού και την ασφάλεια του καταναλωτή. H OTA έχει νεφροτοξικές, ηπατοτοξικές και καρκινογόνες (Class 2Β, ΙΑRC), ιδιότητες στα ζώα και στους ανθρώπους. Δείγματα από σταφύλια και διάφορα παράγωγα προϊόντα τους όπως σταφίδες, χυμοί σταφυλιού και κρασιά από τη νότια Ευρώπη έχουν βρεθεί συχνά μολυσμένα με OTA και σε σημαντικά μεγαλύτερο βαθμό μολυσμένα από τα αντίστοιχα της βόρειας Ευρώπης. Οι πρώτες εκτιμήσεις της Επιτροπής του Κώδικα Διατροφής, βασισμένες σε περιορισμένα ευρωπαϊκά στοιχεία, πρότειναν ότι το κόκκινο κρασί είναι η δεύτερη σημαντικότερη πηγή ανθρώπινης έκθεσης σε OTA, μετά από τα δημητριακά και ακολουθούν ο καφές και η μπύρα. Πιο συγκεκριμένα, το αντικείμενο της μελέτης αποσκοπούσε στο να μελετηθεί η οικολογία των μυκήτων Aspergillus section Nigri στο αμπέλι και να αξιολογηθούν σύγχρονοι τρόποι ολοκληρωμένης διαχείρισής τους με τη βοήθεια της χημικής, βιολογικής και γενετικής-μοριακής αντιμετώπισης των υπεύθυνων μυκοτοξικογόνων μυκήτων. Μια τέτοια μελέτη δεν έχει γίνει ποτέ στην Ελλάδα σε εκτεταμένη κλίμακα και αναμένεται να συμβάλλει σημαντικά στην προώθηση της έρευνας σε αυτή τη σημαντική ασθένεια της αμπέλου, τόσο σε εθνικό όσο και διεθνές επίπεδο. Επιπλέον, θα συμβάλλει στη μείωση του κινδύνου έκθεσης των καταναλωτών σε υψηλά επίπεδα ωχρατοξινών και θα οδηγήσει σε υψηλής ποιότητας και ασφάλειας σταφύλια, σταφίδες και κρασιά. Σε μια προσπάθεια να γίνει πληθυσμιακή διακύμανση και να βρεθούν ενδημικά στελέχη μυκήτων Aspergillus section Nigri από ελληνικούς αμπελώνες, πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες σταφυλιών (κατά τα έτη 2015, 2016, 2017, 2018 και 2019), με στόχο τη συλλογή δεδομένων του πληθυσμού ωχρατοξικογόνων μυκήτων. Δημιουργήθηκε μια συλλογή 260 στελεχών Aspergillus section Nigri. Μοριακή ταυτοποίηση επιλεγμένων στελεχών οδήγησε στο συμπέρασμα ότι στους ελληνικούς αμπελώνες υπάρχουν τόσο biseriate, όσο και uniseriate μαύροι Ασπέργιλλοι όπως έχουν δείξει και προηγούμενες μελέτες. Η φυλογενετική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε με βάση το γενετικό τόπο της βήτα τουμπουλίνης, στις ελληνικές απομονώσεις κατηγοριοποίησε τα στελέχη σε δύο ομάδες: στην ομάδα των biseriate Ασπεργίλλων, με κυρίαρχο είδος το μύκητα A. carbonarius και στην ομάδα των uniseriate Ασπεργίλλων, με τις απομονώσεις να ανήκουν στο είδος A. uvarum. Στο σύνολο των απομονώσεων κυρίαρχοι ήταν οι biseriate απομονώσεις (97,6% των μαύρων Ασπεργίλλων). Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε διερεύνηση της ικανότητας παραγωγής σε επιλεγμένες απομονώσεις A. carbonarius και A. niger, των μυκοτοξινών ωχρατοξίνης Α και φουμονισινών, αντίστοιχα. Παρατηρήθηκε ότι όλα τα στελέχη A. carbonarius ήταν υψηλά ωχρατοξικογόνα, κάτι το οποίο ήταν αναμενόμενο, καθώς υψηλά ωχρατοξικογόνα στελέχη απαντώνται σε σταφύλια που καλλιεργούνται σε θερμές περιοχές, όπως η Ελλάδα (Belli et al., 2005; Pietri et al., 2001; Sage et al., 2004; Serra et al., 2003; Battilani et al., 2006; Chiotta et al., 2013). Αναλυτικότερα, τα επίπεδα της ΟΤΑ κυμάνθηκαν από 136 ppb έως και τα 7.139 ppb. Τα στελέχη που παρήγαγαν τα πιο υψηλά ποσοστά ΟΤΑ απομονώθηκαν από την περιοχή της Πελοποννήσου και Αττικής. Επίσης, 20 απομονώσεις A. niger ελέγχθηκαν ως προς την παραγωγή φουμονισινών και παρατηρήθηκε ότι όλες οι απομονώσεις παρήγαγαν φουμονισίνες, στο μεγαλύτερο ποσοστό τους σε πολύ χαμηλά επίπεδα. Ακολούθησε in vitro η αξιολόγηση 21 διαφορετικών ποικιλιών της αμπέλου, Αγιανιώτικο, Αγιωργίτικο, Αθήρι, Ασύρτικο, Αυγουστιάτης, Γεωργιανά, Κυδωνίτσα, Λαγόρθι, Λημνιό, Μαλαγουζιά, Μανδηλαριά, Μαυροδάφνη, Ντεμπίνα, Ξινόμαυρο, Παύλος, Ραζακί, Ροδίτης, Σαββατιανό, Σιδερίτης, Σταφίδα και Φράουλα ως προς την πιθανή ανθεκτικότητα/ανεκτικότητα τους στο μύκητα A. carbonarius και στην επιμόλυνση τους με ωχρατοξίνες. Παρατηρήθηκε σημαντική παραλλακτικότητα ανάμεσα στις ποικιλίες και τα δύο έτη. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων κονιδίων έδειξαν ένα ευρύ φάσμα τιμών για όλες τις ποικιλίες σταφυλιών που εξετάστηκαν. Όσον αφορά την παραγωγή κονιδίων για το έτος 2018 η πιο ανθεκτική ποικιλία ήταν η Φράουλα και η πιο ευαίσθητη ο Παύλος, ενώ για το 2019 η πιο ανθεκτική ποικιλία ήταν ο Ροδίτης και οι πιο ευαίσθητες η Ντεμπίνα και ο Σιδερίτης. Τα αποτελέσματα της παραγωγής OTA, στις ποικιλίες που εξετάστηκαν in vitro έδειξαν ένα ευρύ φάσμα τιμών-μολύνσεων. Οι ποικιλίες Ροδίτης, Μαυροδάφνη, Αθήρι, Ξινόμαυρο και Ραζακί παρουσίασαν συγκεντρώσεις ΟΤΑ κάτω των 10 ppb, ενώ οι ποικιλίες Κυδωνίτσα, Λαγόρθι, Παύλος και Αυγουστιάτης παρουσίασαν υψηλά επίπεδα παραγωγής ΟΤΑ, με συγκεντρώσεις οι οποίες κυμαινόντουσαν κάτω από 50 ppb. Ακολούθησε προσπάθεια εύρεσης ενδημικών απομονώσεων ζυμών και η αξιολόγησή τους ως προς την ικανότητά τους να χρησιμοποιηθούν ως βιολογικοί παράγοντες, στην καλλιέργεια της αμπέλου, αποτελώντας έτσι βασικό πυλώνα ενός ολοκληρωμένου συστήματος διαχείρισης των ωχρατοξινών στο αμπέλι. Η συλλογή που δημιουργήθηκε αποτελείται από 140 στελέχη ζυμών. Η πιο αποτελεσματική ζύμη στα in vitro πειράματα ήταν η απομόνωση VOL3 (ανήκει στη συλλογή του Εργ. Φυτοπαθολογίας και έχει απομονωθεί από φύλλα αμπέλου), με ποσοστό παρεμπόδισης σχηματισμού κονιδίων 99%, ενώ ως πιο αποτελεσματικές ζύμες στα in situ πειράματα, χαρακτηρίστηκαν 28 απομονώσεις ζυμών, όπου παρήγαγαν ΟΤΑ σε επίπεδα κάτω του ορίου ανίχνευσης της μεθόδου. Στο σύνολο των απομονώσεων το 52,3% κατάφεραν να μειώσουν την παραγόμενη ΟΤΑ. Ένας επιπλέον στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η in vitro αξιολόγηση της επίδρασης 10 αιθέριων ελαίων (EOs) της κανέλας (Cinnamomum zeylanicum), του θυμαριού (Thymus vulgaris), της μέντας (Mentha piperitha), της λεβάντας (Lavandula angustifolia), της μαντζουράνας (Origanum majorana), του τεϊόδεντρου (Melaleuca alternifolia), του δεντρολίβανου (Rosmarinus officinalis), του φασκόμηλου (Salvia sclarea), της σιτρονέλας (Cymbopogon nardus) και του γερανιού (Pelargonium gaveolens) στην ανάπτυξη του μύκητα A. carbonarius, στην παραγωγή της OTA και στην επίδραση της έκφρασης του ρυθμιστικού γονιδίου, του δευτερογενούς μεταβολισμού, AclaeA. Με βάση τα αποτελέσματα της παρεμπόδισης ανάπτυξης των παραγόμενων κονιδίων και της ΟΤΑ, το θυμάρι, η λεβάντα και το δενδρολίβανο ήταν τα πιο αποτελεσματικά για το στέλεχος 5010 και το θυμάρι για το στέλεχος Ac29, ακόμα και στις πιο χαμηλές συγκεντρώσεις. Η κανέλα ήταν και για τα δύο στελέχη αποτελεσματική κυρίως ως προς την παρεμπόδιση ανάπτυξης των στελεχών. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα επιλέχθηκαν τα αιθέρια έλαια της κανέλας, του γερανιού, του θυμαριού, της μέντας, του δενδρολίβανου και της σιτρονέλλας, με στόχο τη διερεύνηση της επίδρασής τους στην έκφραση του ρυθμιστικού γονιδίου του δευτερογενούς μεταβολισμού AclaeA, του μήκυτα A. carbonarius, in vitro. Η κανέλα, το γεράνι και το θυμάρι μείωσαν σημαντικά την έκφραση του γονιδίου AclaeA την τέταρτη ημέρα μετά τη μόλυνση, υποδηλώνοντας έναν πιθανό τρόπο δράσης των αιθερίων ελαίων στην αναστολή της βιοσύνθεσης της ΟΤΑ.Τέλος, έγινε προσπάθεια δημιουργίας ενός μοντέλου ολοκληρωμένης διαχείρισης και αντιμετώπισης της όξινης σήψης και της ΟΤΑ, στην καλλιέργεια της αμπέλου, με συνδυασμό βιολογικής και χημικής αντιμετώπισης των ωχρατοξικογόνων μυκήτων. Στην μελέτη αυτή αξιολογήθηκαν οκτώ δραστικές ουσίες μυκητοκτόνων σκευασμάτων ως προς την ικανότητά τους να μειώνουν τη μυκηλιακή ανάπτυξη εννέα ενδημικών ισχυρά τοξικογόνων απομονώσεων του μύκητα Α. carbonarius με σκοπό να διερευνηθεί η πιθανή ανάπτυξη ανθεκτικότητας. Τα μυκητοκτόνα που αξιολογήθηκαν στην ενότητα αυτή, χρησιμοποιούνται ευρέως για τον έλεγχο διαφόρων φυτοπαθογόνων στην καλλιέργεια της αμπέλου. Ακολούθησαν πειράματα επίδρασης βιολογικών και χημικών σκευασμάτων στον αγρό του Γ.Π.Α., στα Σπάτα Αττικής, κατά τα έτη 2016, 2017, 2018 και 2019. Τα πρώτα τρία χρόνια πραγματοποιήθηκαν μεμονωμένοι ψεκασμοί με τα επιλεχθέντα σκευάσματα, ενώ το 2019 πραγματοποιήθηκαν ψεκασμοί συνδυασμών χημικών και βιολογικών σκευασμάτων. Καθόλα τα τρία έτη τα αποτελέσματα της σοβαρότητας της ασθένειας και της παραγωγής της ΟΤΑ παρουσίασε διακυμάνσεις. Η πιο αποτελεσματική εφαρμογή ως προς τη μείωση της σοβαρότητας της ασθένειας και της παραγωγής της ΟΤΑ ήταν η εφαρμογή του συνδυασμού των Switch® (χημικό σκεύασμα), Scala® (χημικό σκεύασμα) και Vacciplant®, Serenade® και Trianum® (βιολογικά σκευάσματα), κατά το έτος 2019. Η δημιουργία ενός συστήματος ολοκληρωμένης διαχείρισης (IPM) στην καλλιέργεια της αμπέλου θα περιορίσει τη χρήση συνθετικών μυκητοκτόνων και κατ’ επέκταση των επιβλαβών επιπτώσεων που προκαλεί η αλόγιστη χρήση τους και παράλληλα θα βελτιώσει τη βιωσιμότητα του αμπελώνα.