Μελέτη των λοιμώξεων από εντεροβακτηριακά ανθεκτικά στις καρβαπενέμες λόγω παραγωγής β-λακταμασών τάξης Α

Abstract

In this thesis, we focused on the laboratory and clinical investigation of infections caused by carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, producing class A beta lactamases. Bacterial strains were isolated from clinical samples of patients hospitalized in University General Hospital of Ioannina during 2014-2015 and consequently identified and tested for their susceptibility against clinically important antimicrobials. Bacterial strains with reduced susceptibility or resistant to at least one carbapenem were further tested for carbapenemase activity by utilizing phenotypic tests (Modified Hodge Test, Combination Disc Test). The strains presenting positive phenotype for production of class A beta lactamases were further characterized by means of PCR using the appropriate primers, targeting genes encoding class A (KPC) and B (VIM, NDM) carbapenemases as well as extended spectrum β-lactamases (ESBLs: TEM, SHV, CTX-M). 177 K. pneumoniae clinical strains were confirmed by PCR as KPC-producers. Using the ARMS method, we identified the presence of the KPC-2 in 130 and KPC-9 allele in 47 out of 177 strains. The strains of both alleles belonged to the ST258 sequence type. KPC-9 was responsible for a distinct outbreak, part of the KPC-2 outbreak, still ongoing in our hospital till today. Comparison of the two alleles antimicrobial susceptibility profiles revealed statistically significant increase in MIC for ceftazidime (p=0.03) and higher resistance to amikacin (p=0.012) and colistin (p<0.001) for KPC-9 compared to KPC-2 allele. KPC-2 and KPC-9 alleles differed significantly in respect to the frequency of co-harboured ESBL genes. The majority of KPC-9 strains (93.6%) co-harboured blaTEM. On the other hand, KPC-2 strains co-harboured most frequently blaTEM (73.8%), often in combination with blaSHV (22.3%) and blaCTX-M (13.1%). Mortality related to K. pneumoniae KPC strains was high in our hospital (39.6%), especially in the case of blood stream infections (61.5%), not affected by the type of KPC allele. This study demonstrated the heterogeneity of resistance genes in carbapenem-resistant K. pneumoniae within a single hospital setting and the need for immediate containment measures.

Στη διατριβή αυτή πραγματοποιήθηκε εργαστηριακή και κλινική διερεύνηση των λοιμώξεων από στελέχη Εντεροβακτηριακών με αντοχή στις καρβαπενέμες, λόγω παραγωγής β-λακταμασών τάξης Α. Τα Εντεροβακτηριακά στελέχη απομονώθηκαν από κλινικά δείγματα ασθενών που νοσηλεύτηκαν στο ΠΓΝΙ κατά τη διετία 2014-2015 και ακολούθησε η ταυτοποίηση και ο προσδιορισμός της ευαισθησίας στα συνήθη αντιβιοτικά. Τα στελέχη που παρουσίασαν μειωμένη ευαισθησία ή αντοχή σε τουλάχιστον μία καρβαπενέμη ελέγχθηκαν περαιτέρω για την ανίχνευση παραγωγής καρβαπενεμάσης μέσω φαινοτυπικών δοκιμασιών (Modified Hodge test, δοκιμασία συνδυαασμού δίσκων). Τα στελέχη με θετικό φαινότυπο για παραγωγή β-λακταμασών τάξης Α χαρακτηρίστηκαν επίσης γονοτυπικά μέσω ανίχνευσης και ταυτοποίησης με PCR, με χρήση των κατάλληλων εκκινητών (primers), των γονιδίων που κωδικοποιούν καρβαπενεμάσες τάξης Α (KPC) και τάξης Β (VIM, NDM) καθώς και ευρέως φάσματος β-λακταμάσες (ESBLs: TEM, SHV, CTX-M). Συνολικά, 177 στελέχη K. pneumoniae και δύο στελέχη E. coli επιβεβαιώθηκαν μέσω της PCR ότι παράγουν καρβαπενεμάση KPC. Μέσω της μεθόδου ARMS, βρέθηκε ότι από τα 177 στελέχη K. pneumoniae, τα 130 ανήκαν στον υπότυπο KPC-2 ενώ τα 47 ήταν KPC-9. Τα στελέχη και από τα δύο αλλήλια ανήκαν στον τύπο στελέχους ST258. Τα στελέχη KPC-9 εμφάνισαν συρροή κρουσμάτων παράλληλα με τα KPC-2, η οποία πιθανότατα οφείλεται σε ενδονοσοκομειακή διασπορά και συνεχίζεται μέχρι και σήμερα στο ΠΓΝΙ. Η σύγκριση των δύο αλληλίων όσον αφορά την ευαισθησία τους στα συνήθη αντιβιοτικά, ανέδειξε στατιστικά σημαντική αύξηση στην MIC για την κεφταζιδίμη (p=0,03) και υψηλότερη ανθεκτικότητα στην αμικασίνη (p=0,012) και την κολιστίνη (p<0,001) για το KPC-9 σε σύγκριση με το KPC-2. Η στατιστική ανάλυση έδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά όσον αφορά τη συχνότητα εμφάνισης και για τα τρία ESBL γονίδια (CTX-M, TEM και SHV) στα στελέχη KPC-9 και KPC-2. Τα στελέχη KPC-9 κατά συντριπτική πλειοψηφία (93,6%) φέρουν το γονίδιο ΤΕΜ. Από την άλλη, τα στελέχη KPC-2 φέρουν, συγκριτικά με τα υπόλοιπα γονίδια ESBL, το ΤΕΜ σε μεγαλύτερη συχνότητα (73,8%), το οποίο συχνά συνδυάζετε με το SHV (22,3%) και το CTX-M (13,1%). Η θνητότητα από KPC στελέχη K. pneumoniae στο νοσοκομείο μας είναι υψηλή (39,6%), ιδιαίτερα στις λοιμώξεις της αιματικής ροής (61,5%) και δεν επηρεάζεται από τον τύπο του αλληλίου. Από τη μελέτη αυτή γίνεται φανερή η ετερογένεια ως προς τα γονίδια αντοχής που παρουσιάζουν τα στελέχη K. pneumoniae, τα οποία απομονώθηκαν εντός του ίδιου νοσοκομείου καθώς και η ανάγκη για την εφαρμογή προληπτικών και περιοριστικών μέτρων για την αντιμετώπιση της διασποράς των πολυανθεκτικών παθογόνων στο νοσοκομείο μας.