Ανάπτυξη και χαρακτηρισμός πολυστρωματικών πολυμερικών μεμβρανών με ελεγχόμενη βιοδραστικότητα για εφαρμογές συσκευασίας

Abstract

The growing need to maintain food quality during long distribution periods—without using preservatives or other chemical additives—has led researchers to explore new types of active packaging based on natural bioactive substances. Although many studies exist on incorporating these substances into flexible food packaging, there are still important issues that need further investigation. Researchers face challenges related to the physical and chemical properties of natural bioactive compounds, such as their volatility, sensitivity to heat, and polarity. It is also important to maintain the main functions of packaging materials (i.e. mechanical performance, barrier properties, etc.) after the addition of these compounds. This thesis aims to address such challenges by encapsulating natural substances to protect and improve their activity. The encapsulated substances are then incorporated into multilayered flexible polyethylene (LDPE) films with different composition/layouts to achieve optimal performance. The bioactive substances studied here include essential oil compounds (thymol and carvacrol) and compounds from olive leaf extracts (hydroxytyrosol and phenolic acids), known for their antioxidant, and antimicrobial properties. Various methods were used to stabilize these substances, including creating micro and nanoparticles, complexes, and emulsions, to reduce unwanted oxidation, increase heat stability, and control their release and availability during mixing and coating processes. Specifically, thymol encapsulation was carried out using three methods: solvent evaporation with ethyl cellulose carriers, absorption into zeolite and activated carbon, and loading into yeast cells (S. cerevisiae). Key parameters such as the concentrations of thymol, polymer, and emulsifier (for solvent evaporation), the type and duration of liquid exposure (for adsorption), and encapsulation time and temperature (for yeast loading) were investigated. The encapsulation efficiency and thermal stability of the thymol loaded carriers were evaluated using simultaneous thermal analysis (STA) and Fourier transform infrared spectroscopy with attenuated total reflectance (FTIR-ATR).Clay-based carriers were also employed to develop multilayer films on the laboratory scale. The most effective carriers were blended with low density polyethylene (LDPE) to produce nano-modified films, which were then used to form two-layer structures. Additionally, emulsions and suspensions containing bioactive compounds were applied as coatings onto LDPE films, resulting in coated two-layer films. By combining blending and coating techniques, three-layer “bioactive reservoir” films were created and subsequently studied. These multilayer films were evaluated for their mechanical properties, bioactive compound release profiles, and antimicrobial and antioxidant activities—both immediately after production and following prolonged storage. Some of the films were also used for packaging cherry tomatoes to assess their effectiveness in maintaining freshness over time. At the pilot industrial scale, process parameters for incorporating nanocarriers into LDPE using a twin-screw extruder were optimized. These bioactive blends were then processed into films using standard industrial methods. Two-layer films were produced via coextrusion, while selected coating formulations were applied through a methodology that simulates flexographic printing to create three-layer films. Particles prepared via solvent evaporation enhanced the thermal stability of thymol and enabled its sustained release while retaining antimicrobial efficacy for at least one month. Although the quantity of these particles was limited, they were successfully used in patches for cherry tomato packaging, extending shelf life by at least 7 days. Thymol encapsulated in activated carbon and S. cerevisiae also demonstrated improved heat stability, in contrast to hydrophilic zeolite, which reduced thermal stability. Incorporation of bioactive compounds via biopolymer coatings had minimal effects on mechanical properties, whereas encapsulation in nano- or micro-carriers led to more significant reductions, particularly in tensile strength and elongation at break. This was likely due to uneven carrier distribution during lab scale blending. However, mixing via industrial twin screw extrusion greatly improved dispersion and film performance. Films incorporating zeolite, activated carbon, or organoclay nanocarriers released minimal amounts of thymol and exhibited weak antimicrobial activity, likely due to barriers imposed by the plastic matrix. Conversely, films containing S. cerevisiae released higher levels of thymol and showed strong antimicrobial effects, attributed to visible aggregates on the film surface. All coated films demonstrate rapid release and potential antimicrobial action. Hydrophilic coating materials like methylcellulose or gelatin facilitated immediate release, while ethyl cellulose provided a slower, more controlled release. Part of this Doctoral Dissertation is integrated into a broader research project focused on the development of flexible films with controlled antimicrobial and antioxidant activity for food packaging materials. This research was carried out under the project entitled AntiMicrOxiPack. The project was funded under the Special Actions of the Operational Program “Competitiveness, Entrepreneurship and Innovation (EPAnEK)” of the NSRF 2014–2020. Research areas included: the enzymatic processing of olive leaf extracts to produce selected bioactive products with proven antimicrobial and antioxidant properties; the study of antimicrobial activity against the bacterium E. coli; and investigations into the release and antioxidant performance of these compounds. These studies were conducted at the Biotechnology Laboratory of the Department of Biological Applications and Technologies at the University of Ioannina. The adsorption of bioactive compounds into the interlayer or surface of layered clays using green methodologies, as well as their incorporation into low density polyethylene (LDPE) using a small-scale extruder, was carried out at the Food Technology Laboratory of the Department of Food Science and Technology, University of Patras, based in Agrinio. The scaleup of the production process for bioactive blends of LDPE/bioactive clay carriers in a mixer and/or medium scale twin screw extruder was performed in collaboration with the Polymer Technology Laboratory of the School of Chemical Engineering at the National Technical University of Athens (NTUA). Characterization of the nanocarriers and films in terms of their antimicrobial activity against pathogenic bacteria such as Salmonella Enteritidis and Listeria monocytogenes was conducted at the Laboratory of Chemical and Microbiological Analyses of IPER. The pilot scale industrial production of the multilayer films and their standard industrial quality control were carried out in collaboration with the company Achaika Plastics S.A.

Η συνεχώς αυξανόμενη ανάγκη διατήρησης της ποιότητας των τροφίμων κατά τη διάρκεια των εκτεταμένων χρονοδιαγραμμάτων διανομής τους χωρίς τη χρήση συντηρητικών ή άλλων χημικών πρόσθετων έχει στρέψει το ενδιαφέρον της ερευνητικής κοινότητας στην ανάπτυξη καινοτόμων δομών ενεργούς συσκευασίας με βάση βιοδραστικές ουσίες φυσικής προέλευσης. Παρότι σήμερα υπάρχει πληθώρα μελετών σχετικά με την ενσωμάτωση βιοδραστικών ουσιών φυσικής προέλευσης στην εύκαμπτη συσκευασία τροφίμων υπάρχουν σημαντικά θέματα που χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης. Η ερευνητική κοινότητα καλείται να αντιμετωπίσει τόσο προκλήσεις που σχετίζονται με τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των βιοδραστικών ουσιών φυσικής προέλευσης όπως η πτητική τους φύση, η θερμική τους ευαισθησία και η πολικότητα αλλά και προκλήσεις που σχετίζονται με την υποβάθμιση των λειτουργικών χαρακτηριστικών της συσκευασίας έπειτα από την ενσωμάτωσή τους. Στο πλαίσιο αυτό η παρούσα διατριβή αποσκοπεί να συνεισφέρει στην αντιμετώπιση των προκλήσεων που προαναφέρθηκαν μέσω της ενθυλάκωσης ουσιών φυσικής προελεύσεως με σκοπό την παροχή προστασίας και την ενίσχυση της δράσης τους και ακολούθως στην ενσωμάτωση τους σε πολυστρωματικές εύκαμπτες μεμβράνες πολυαιθυλενίου χαμηλής πυκνότητας (LDPE) διαφορετικής αρχιτεκτονικής με στόχο την επίτευξη της βέλτιστης λειτουργικότητας. Ως βιοδραστικές ουσίες μελετήθηκαν ενώσεις που ανήκουν στην κατηγορία των αιθέριων ελαίων (θυμόλη και καρβακρόλη), καθώς και βιοδραστικές ενώσεις από εκχυλίσματα φύλλων ελιάς (υδροξυτυροσόλη και φαινολικά οξέα) με ενισχυμένη αντιοξειδωτική και αντιμικροβιακή δράση. Μελετήθηκε η σταθεροποίηση των βιοδραστικών ουσιών, μέσω εγκλεισμού/ενθυλάκωσης/σύμπλεξης, ακολουθώντας διάφορες προσεγγίσεις, που βασίζονται στη δημιουργία βιοενεργών συμπλόκων, μίκρο-, νανο-, σωματιδίων, γαλακτωμάτων, κ.α. Με αυτό τον τρόπο επιχειρήθηκε η ελαχιστοποίηση της ανεπιθύμητης οξείδωσης των ευαίσθητων συστατικών, η αύξηση της θερμικής τους σταθερότητας, καθώς και ο έλεγχος της απελευθέρωσης των πτητικών ενώσεων και βιοδιαθεσιμότητάς τους τόσο κατά την ανάμειξη των βιοδραστικών φορέων με το LDPE, όσο και κατά την επίστρωσή του. Πιο συγκεκριμένα μελετήθηκε η ενθυλάκωση θυμόλης με τη μέθοδο εξάτμισης του διαλύτη σε αιθυλοκυτταρίνη, σε νανοφορείς ζεόλιθου και ενεργού άνθρακα με προσρόφηση από υγρό μέσο καθώς και σε κύτταρα ζυμομύκητα του είδους S. cerevisiae. Οι κύριες παράμετροι που εξετάστηκαν στην ενθυλάκωση με τη μέθοδο εξάτμισης του διαλύτη ήταν η περιεκτικότητα βιοδραστικής, πολυμερούς και γαλακτωματοποιητή. Αντίστοιχα στην ενθυλάκωση με προσρόφηση εξετάστηκε ο χρόνος και η φύση του υγρού μέσου προσρόφησης, ενώ στην ενθυλάκωση σε κύτταρα S. cerevisiae μελετήθηκε η επίδραση του χρόνου ενθυλάκωσης και η θερμοκρασία. Η ικανότητα ενθυλάκωσης της βιοδραστικής καθώς και η θερμική απόκριση των φορέων θυμόλης εξετάστηκε με ταυτόχρονη θερμική ανάλυση (STA), ενώ οι λειτουργικές ομάδες αναλύθηκαν με φασματοσκοπία υπέρυθρου μετασχηματισμού Fourier με εξασθενημένη ολική ανάκλαση (FTIR-ATR). Παράλληλα με τους φορείς που προαναφέρθηκαν στο πλαίσιο της παρούσας μελέτης εξετάστηκαν και φορείς βιοδραστικών ενώσεων με βάση τη φυλλόμορφη άργιλο. Οι φορείς αυτοί αξιοποιήθηκαν για την ανάπτυξη πολυστρωματικών μεμβρανών διαφορετικής αρχιτεκτονικής, αρχικά σε εργαστηριακό επίπεδο. Συγκεκριμένα οι βέλτιστοι φορείς ενσωματώθηκαν στο LDPE μέσω ανάμειξης τήγματος, μορφοποιήθηκαν σε νανοτροποποιημένες μεμβράνες, και συνενώθηκαν με μεμβράνες LDPE για την παρασκευή των βιοδραστικών διστρωματικών μεμβρανών από ανάμειξη τήγματος. Επιπλέον αναπτύχθηκαν διαλύματα, γαλακτώματα και αιωρήματα βιοδραστικών ουσιών/φορέων με θυμόλη/καρβακρόλη/εκχύλισμα φύλλων ελιάς για την εφαρμογή ως επικαλύψεις σε υπόστρωμα μεμβράνης LDPE και την ανάπτυξη των βιοδραστικών διστρωματικών επικαλυμμένων μεμβρανών. Η συνδυασμένη ενσωμάτωση των λειτουργικών φορέων μέσω ανάμειξης τήγματος και επίστρωσης οδήγησε στην ανάπτυξη τριστρωματικών μεμβρανών τύπου «δεξαμενής βιοδραστικότητας», οι οποίες μελετήθηκαν στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής. Σε επίπεδο εργαστηριακών δοκιμών οι πολυστρωματικές μεμβράνες εξετάστηκαν κυρίως ως προς τη μηχανική τους συμπεριφορά σε δοκιμές εφελκυσμού, ως προς το ρυθμό απελευθέρωσης της βιοδραστικότητας, ως προς την αντιμικροβιακή και την αντιοξειδωτική τους δράση αμέσως μετά τη παρασκευή αλλά και μετά από παρατεταμένη αποθήκευση, ενώ σε επιλεγμένες μεμβράνες συσκευάστηκαν ντοματίνια και μελετήθηκε η δυνατότητα διατήρησης της ποιότητας τους με τη πάροδο του χρόνου. Σε επίπεδο βιομηχανικής πιλοτικής παραγωγής βελτιστοποιήθηκαν οι παράμετροι παραγωγής αναμειγμάτων νανοφορέων με LDPE σε δικόχλιο εξωθητή μεσαίας κλίμακας. Τα αναμείγματα που προέκυψαν χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή μεμβρανών με βιομηχανικά συμβατές τεχνολογίες. Πιο συγκεκριμένα, εφαρμόστηκε η μέθοδος της συνεξώθησης για την παραγωγή διστρωματικών μεμβρανών που ενσωματώνουν τους βιοδραστικούς φορείς μέσω ανάμειξης τήγματος. Στη συνέχεια επιλεγμένα διαλύματα εφαρμόστηκαν στην επιφάνεια των διστρωματικών μεμβρανών με τη βοήθεια μεθόδου η οποία προσομοιάζει την φλεξογραφική για την παραγωγή των τριστρωματικών μεμβρανών τύπου δεξαμενής βιοδραστικότητας σε βιομηχανικό πιλοτικό επίπεδο. Από τη μέθοδο εξάτμισης του διαλύτη προέκυψαν σωματίδια που προσέφεραν αυξημένη θερμική σταθερότητα της θυμόλης, παρατεταμένη απελευθέρωση της με αντιμικροβιακή δράση που διατηρήθηκε για τουλάχιστον ένα μήνα μετά από την παρασκευή τους. Η μικρή παραγωγή σωματιδίων με τη μέθοδο εξάτμισης του διαλύτη δεν ευνόησε την ενσωμάτωση τους σε μεμβράνες, ωστόσο τα σωματίδια εφαρμόστηκαν με τη μορφή επιθεμάτων σε συσκευασία με ντοματίνια επιτυγχάνοντας τη διατήρηση των ποιοτικών τους χαρακτηριστικών για τουλάχιστον 7 ημέρες επιπλέον από τα αντίστοιχα ντοματίνια που αποθηκεύτηκαν χωρίς τα σωματίδια θυμόλης. Ευεργετική ως προς τη θερμική σταθερότητα ήταν και η ενθυλάκωση της θυμόλης σε ενεργό άνθρακα και στο S.cerevisiae πιθανό λόγω της οργανικής τους φύσης σε αντίθεση με τον υδρόφιλο ανόργανο ζεόλιθο που υποβάθμισε τη θερμική σταθερότητα της θυμόλης. Από τη σκοπιά της μηχανικής απόκρισης των μεμβρανών η προσθήκη των βιοδραστικών ενώσεων μέσω σύμπλεξης σε βιοπολυμερή (μεθυλοκυτταρίνη/αιθυλοκυτταρίνη/ζελατίνη) και επικάλυψης επέφερε μικρές μεταβολές κυρίως στην αντοχή και την παραμόρφωση στη θραύση, ενώ η ελάττωση αυτών των μηχανικών παραμέτρων ήταν εμφανέστερη στις επικαλύψεις όπου είχε προηγηθεί η ενθυλάκωση σε νανο- και μίκρο-φορείς. Αντίστοιχα οι διστρωματικές μεμβράνες από ανάμειξη τήγματος με ζεόλιθο, ενεργό άνθρακα και S.cerevisiae παρουσίασαν εντονότερη ελάττωση αυτών των μηχανικών παραμέτρων και παράλληλα ελάττωση του μέτρου ελαστικότητας. Τα ευρήματα συνδέθηκαν με τη κακή διασπορά των φορέων στην πολυμερική μήτρα, αφού για την ανάμειξη τήγματος εφαρμόστηκε μία εργαστηριακή μη-βελτιστοποιημένη μεθοδολογία. Αντίθετα, στην περίπτωση που η ανάμειξη τήγματος πραγματοποιείται με τη βοήθεια δικόχλιου εξωθητή, όπως κατά την ανάμειξη φορέων θυμόλης με βάση τον οργανόφιλο πηλό, οι διστρωματικές μεμβράνες που προέκυψαν παρουσίασαν εμφανώς μικρότερες αποκλίσεις των μηχανικών ιδιοτήτων τους σε σχέση με τις μεμβράνες αναφοράς.Ως προς τα λειτουργικά χαρακτηριστικά οι διστρωματικές μεμβράνες από ανάμειξη τήγματος με τους νανοφορείς ζεόλιθου, ενεργού άνθρακα και οργανόφιλου πηλού απελευθερώνουν μικρές ποσότητες βιοδραστικής και δε παρουσιάζουν αντιμικροβιακή δράση πιθανόν εξαιτίας της παρεμπόδισης από την πολυμερική μήτρα που παρεμβάλλεται μεταξύ των νανοσωματιδίων. Αντίθετα οι διστρωματικές μεμβράνες με φορείς S.cerevisiae απελευθερώνουν υψηλότερα επίπεδα της βιοδραστικής και συνεπώς παρουσιάζουν και ισχυρή αντιμικροβιακή δράση καθώς οι φορείς μετά τη θερμική τους επεξεργασία απαντώνται με τη μορφή συσσωματωμάτων στην επιφάνεια των πολυμερικών μεμβρανών. Όλες οι επικαλυμμένες μεμβράνες παρουσιάζουν ταχύτερη απελευθέρωση υψηλών ποσοτήτων της βιοδραστικής από ότι οι αντίστοιχες διστρωματικές από ανάμειξη τήγματος και ως εκ τούτου παρουσιάζουν ισχυρή αντιμικροβιακή δράση. Επικαλύψεις με βάση υδρόφιλα πολυμερή όπως η μεθυλοκυτταρίνη ή ζελατίνη απελευθερώνουν ακαριαία τη βιοδραστική μέσω της διάλυσης τους, ενώ αντίθετα η μη υδρόφιλη αιθυλοκυτταρίνη απελευθερώνει πιο σταδιακά τη βιοδραστική. Οι πολυστρωματικές μεμβράνες που παρήχθησαν σε πιλοτικό βιομηχανικό επίπεδο δεν εμφανίζουν σημαντική αλλοίωση των ποιοτικών χαρακτηριστικών τους που να περιορίζει την αξιοποίησή τους σε βιομηχανικό επίπεδο. Ως προς την λειτουργικότητα τους οι τριστρωματικές μεμβράνες παρουσίασαν αντιοξειδωτική δράση καθώς και έντονη αναστολή στην ανάπτυξη του βακτηρίου Salmonella Enteritis γεγονός που τις καθιστά θεωρητικά κατάλληλες για εφαρμογή σε όλα τα τρόφιμα. Τμήμα της παρούσας Διδακτορικής διατριβής αποτελεί μέρος μιας εκτενέστερης έρευνας που εστιάζει στην ανάπτυξη εύκαμπτων μεμβρανών με ελεγχόμενη αντιμικροβιακή και αντιοξειδωτική δράση για υλικά συσκευασίας τροφίμων, η οποία πραγματοποιήθηκε στο πλαίσιο του ερευνητικού έργου με κωδική ονομασία AntiMicrOxi-Pack. Το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε στο πλαίσιο των Ειδικών Δράσεων του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Ανταγωνιστικότητα, Επιχειρηματικότητα και Καινοτομία (ΕΠΑνΕΚ)» του ΕΣΠΑ 2014 –2020. Τομείς όπως η ενζυμική επεξεργασία εκχυλισμάτων φύλλων ελιάς για την παραγωγή επιλεγμένων βιοδραστικών προϊόντων με τεκμηριωμένη αντιμικροβιακή και αντιοξειδωτική δράση, η μελέτη της αντιμικροβιακής δράσης έναντι του βακτηρίου E.coli, η μελέτη της απελευθέρωσης και της αντιοξειδωτικής δράσης πραγματοποιήθηκαν στο Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας του Τμήμα-τος Βιολογικών Εφαρμογών και Τεχνολογιών του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων. Η προσρόφηση βιοδραστικών ενώσεων στην ενδοστρωματική περιοχή/επιφάνεια της φυλλόμορφης αργίλου με εφαρμογή πράσινων μεθόδων και η ενσωμάτωση τους στο χαμηλής πυκνότητας πολυαιθυλένιο με εργαστηριακό εξωθητή μικρής κλίμακας πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Τεχνολογίας Τροφίμων του Τμήματος Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων του Πανεπιστημίου Πατρών με έδρα το Αγρίνιο. Η κλιμάκωση της διεργασίας παραγωγής «κύριων αναμειγμάτων» LDPE/βιοδραστικών φορέων αργίλου σε αναμίκτη ή/και δικόχλιο εξωθητή μεσαίας κλίμακας πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία με το Εργαστήριο Τεχνολογίας Πολυμερών, της Σχολής Χημικών Μηχανικών, του Εθνικού Μετσόβιου Πολυτεχνείου. Ο χαρακτηρισμός των νανοφορέων και των μεμβρανών έναντι των παθογόνων βακτηρίων Salmonella Enteritis, Listeria monocytogenes έλαβε χώρα στο Εργαστήριο Χημικών και Μικροβιολογικών Αναλύσεων ΗΠ. ΕΡ. Η πιλοτική βιομηχανική παραγωγή των πολυστρωματικών μεμβρανών και ο τυπικός βιομηχανικός έλεγχος τους πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία με την εταιρία ΑΧΑΪΚΑ ΠΛΑΣΤΙΚΑ Α.Ε.Β.Ε.