Μελέτη της γενετικής και φαινοτυπικής παραλλακτικότητας των γηγενών ζυμομυκήτων του ελληνικού terroir και η επίδρασή τους στις αισθητηριακές ιδιότητες των οίνων

Abstract

Climate change has intensified environmental stressors for wine yeasts, primarily by increasing sugar concentrations in grapes at harvest. Consequently, many commercial yeast strains isolated in the past may struggle to adapt to these evolving conditions. Meanwhile, the wine industry is becoming increasingly competitive, making differentiation and the creation of distinctive wine styles essential. In response to these challenges, modern winemaking increasingly favors the use, selection and commercialization of indigenous yeast strains due to their ability to preserve the unique microbial terroir of spontaneous fermentations, enhance fermentation capacity, and adapt to their native environment. Moreover, they maintain the typical organoleptic properties and link wine characteristics with the area of origin (terroir). The primary objective of the present thesis was to investigate the genetic and phenotypic diversity of indigenous yeasts isolated from wines of the Greek terroir, and to evaluate their oenological potential. In addition, indigenous yeasts’ fermentative capacity and impact on the chemical and sensory characteristics of wine were assessed through laboratory-scale fermentations in both monocultures and mixed culture assays. Firstly, chapter 1 serves as a literature review, presenting information and findings from previous studies related to the investigated subject. Specifically, it offers valuable insights into microbial dynamics in winemaking, the challenges associated with selecting starter cultures for inoculation, the contribution of yeasts to the aromatic profile of wine, and the interactions that occur between different yeast species during fermentation. In Chapter 2, the main objective was to investigate the population diversity of yeast species from spontaneously fermented wines, create a large collection of new yeast isolates and categorize them based on their oenological potential. In fact, fourteen spontaneously fermented wines from different regions of Greece were analyzed for yeast diversity. Molecular identification at the species level was conducted using RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) fingerprinting with the M13 primer, in conjunction with Matrix Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS). The isolates were assessed for interesting oenological traits. Additionally, S. cerevisiae isolates were subjected to strain-level differentiation using interdelta-PCR fingerprinting and evaluated for their fermentative performance in laboratory-scale fermentations on pasteurized grape must. Sensory evaluation was performed to classify wines based on their organoleptic characteristics. Among the 190 yeast isolates identified, S. cerevisiae was predominant, while less common non-Saccharomyces species, including Trigonopsis californica, Priceomyces carsonii, Zygosaccharomyces bailii, Brettanomyces bruxellensis, and Pichia manshurica, were detected in lower abundances. The abovementioned non-conventional, non-Saccharomyces isolates will be further examined in Chapter 4. Phenotypic profiling revealed four distinct yeast clusters, while strain-level analysis identified 20 distinct S. cerevisiae strains. Moreover, a geographically ubiquitous S. cerevisiae strain (S10-A6Y10) with exceptional fermentation capabilities was presented. Sensory analysis confirmed significant variations in the produced wines, validating the proposed yeast classification. This chapter introduces a novel biostatistical approach for the rapid screening and classification of indigenous wine yeasts, facilitating efficient preliminary selection. Concerning Chapter 3, the impact of four indigenous S. cerevisiae strains (S6-A6Y6, S10-A6Y10, S20-A26Y5, and S14-K33Y14), isolated and characterized from Chapter 2, was investigated on the sensory profile of Assyrtiko wines. Towards that direction, Gas Chromatography-Olfactometry/Mass Spectrometry (GC-O/MS) identified aroma-active volatiles, while volatile thiols were quantified via GC/MS and correlated with sensory attributes. Results demonstrated that S. cerevisiae S10-A6Y10 contributed to a complex aromatic profile, whereas S. cerevisiae S14-K33Y14 introduced smoky wood notes linked to furaneol production. All strains enhanced volatile thiol production, with 3-sulfanylhexan-1-ol (3SH), 3SH acetate (3SHA), and benzenemethanethiol (BM) exceeding their sensory thresholds. This study is the first to integrate qualitative and quantitative data to distinguish the aromatic fingerprint of Assyrtiko wines based solely on fermentation inoculum, highlighting the significant role of indigenous S. cerevisiae strains in shaping the final sensory profile. In Chapter 4, five non-conventional, non-Saccharomyces species - Z. bailii, P. carsonii, T. californica, and P. manshurica - which were identified during the final stages of spontaneous fermentations as reported in Chapter 2, were evaluated for their potential in white wine fermentation using Assyrtiko grapes from Santorini. Fermentation kinetics and sensory analysis, was first employed to test the oenological potential of the yeast strains. Based on their performance, two strains of Z. bailii (Zb-A19Y5 and Zb-K29Y2) and one strain of T. californica (Tc-A9Y1) selected for further analysis. T. californica Tc-A9Y1 produced dry wine with lower alcohol content than the other experimental wines. None of the wines exhibited off-flavor and the aromatic profile of each sample revealed distinct chemical signature. Zb-A19Y5 exhibited the highest scores for several sensorial attributes, namely, aromatic intensity, fruitiness, citrus, acidity, and aromatic aftertaste. The current results highlight the potential of non-Saccharomyces strains in producing quality wines while adapting to global warming conditions, presenting new opportunities for the wine industry. Chapter 5 unravels the interactions between the selected indigenous Z. bailii and S. cerevisiae strains from Chapters 3 and 4, in pure and mixed fermentations, analyzing their impact on fermentation kinetics, microbial dynamics, and wine aromatic profiles. In an initial fermentation experiment, both pure and mixed cultures of Z. bailii Zb-A19Y5 and two S. cerevisiae strains (S10-A6Y10 and S14-K33Y14) were introduced, with fermentation kinetics and population dynamics closely monitored. To assess the impact of different inoculation strategies, the most efficient S. cerevisiae strain (S10-A6Y10) was selected for a subsequent fermentation trial, comparing sequential and simultaneous co-inoculation against pure cultures of Z. bailii and S. cerevisiae. This chapter emphasized on fermentation kinetics, microbial interactions, and oenological characteristics. The wine’s aromatic composition was determined using GC-MS, while sensory analysis provided an overall assessment of the effects of inoculation strategies. The results indicated that mixed cultures of Z. bailii and S. cerevisiae accelerated fermentation and promoted Z. bailii growth, suggesting a cooperative interaction. Additionally, Z. bailii exhibited valuable oenological traits, including alcohol tolerance, fructophilic behavior, malic acid consumption, and the release of varietal thiols. In conclusion, co-inoculation emerged as the most effective strategy, producing wines with intensified citrus, passion fruit, and floral aromas.

Η κλιματική αλλαγή έχει εντείνει τους περιβαλλοντικούς στρεσογόνους παράγοντες για τους ζυμομύκητες του οίνου, κυρίως λόγω της αύξησης της συγκέντρωσης των σακχάρων στα σταφύλια κατά τον τρύγο. Κατά συνέπεια, πολλά εμπορικά στελέχη ζυμομυκήτων που απομονώθηκαν στο παρελθόν δυσκολεύονται να προσαρμοστούν σε αυτές τις νέες συνθήκες. Παράλληλα, ο οινοπαραγωγικός τομέας γίνεται όλο και πιο ανταγωνιστικός, καθιστώντας τη διαφοροποίηση και τη δημιουργία οίνων με μοναδικό χαρακτήρα απαραίτητο. Ως απάντηση σε αυτές τις προκλήσεις, η σύγχρονη οινοποίηση ευνοεί ολοένα και περισσότερο τη χρήση, επιλογή και εμπορευματοποίηση αυτοχθόνων στελεχών ζυμομυκήτων λόγω της ικανότητάς τους να διατηρούν το μοναδικό μικροβιακό αποτύπωμα των αυθόρμητων ζυμώσεων, να ενισχύουν τη ζυμωτική ικανότητα και να προσαρμόζονται εύκολα στο περιβάλλον από το οποίο απομονώθηκαν. Επιπλέον, διατηρούν τις τυπικές οργανοληπτικές ιδιότητες και συνδέουν τα χαρακτηριστικά του οίνου με την περιοχή προέλευσης (terroir). Ο πρωταρχικός στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση της γενετικής και φαινοτυπικής ποικιλότητας των αυτόχθονων ζυμομυκήτων που απομονώθηκαν από οίνους του ελληνικού terroir και η αξιολόγηση του οινολογικού τους δυναμικού. Επιπλέον, η ζυμωτική ικανότητα των αυτόχθονων ζυμών και η επίδρασή τους στα αρωματικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του οίνου αξιολογήθηκαν μέσω ζυμώσεων εργαστηριακής κλίμακας τόσο σε μονοκαλλιέργειες όσο και σε μικτές καλλιέργειες. Αρχικά, το κεφάλαιο 1 αποτελεί μία βιβλιογραφική ανασκόπηση, παρουσιάζοντας πληροφορίες και ευρήματα από προηγούμενες μελέτες που σχετίζονται με το υπό μελέτη θέμα. Συγκεκριμένα, προσφέρει πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με τις μικροβιακές κοινότητες στο περιβάλλον οινοποίησης, τις προκλήσεις που σχετίζονται με την επιλογή των καλλιεργειών εκκίνησης, τη συμβολή των ζυμομυκήτων στο αρωματικό προφίλ του οίνου και τις μικροβιακές αλληλεπιδράσεις που συμβαίνουν μεταξύ των διαφόρων ειδών ζυμομυκήτων κατά τη διάρκεια της ζύμωσης. Στο κεφάλαιο 2, ο κύριος στόχος ήταν η διερεύνηση της βιοποικιλότητας των ζυμομυκήτων από αυθόρμητα ζυμώμενους οίνους, η δημιουργία μιας μεγάλης συλλογής νέων απομονώσεων ζύμης και η κατηγοριοποίησή τους με βάση το οινολογικό τους δυναμικό. Προς αυτή την κατέυθυνση, δεκατέσσερις οίνοι αυθόρμητης ζύμωσης από διαφορετικές περιοχές της Ελλάδας αναλύθηκαν μέσω μικροβιολογικών και μοριακών αναλύσεων με στόχο την απομόνωση γηγενών ζυμομυκήτων. Η μοριακή ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους πραγματοποιήθηκε με τη χρήση δακτυλικού αποτυπώματος RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) με τον εκκινητή M13, σε συνδυασμό με τη μέθοδο Matrix Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS). Οι απομονώσεις αξιολογήθηκαν ως προς ορισμένα τεχνολογικά χαρακτηριστικά με οινολογικό ενδιαφέρον. Επιπλέον, τα απομονωμένα S. cerevisiae στελέχη υποβλήθηκαν σε διαφοροποίηση σε επίπεδο στελέχους με τη χρήση της interdelta-PCR και αξιολογήθηκαν ως προς τη ζυμωτική τους απόδοση σε ζυμώσεις εργαστηριακής κλίμακας σε παστεριωμένο γλεύκος της ποικιλίας «Ασύρτικο». Ταυτόχρονα, πραγματοποιήθηκε αισθητηριακή αξιολόγηση για την ταξινόμηση των οίνων με βάση τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά τους. Μεταξύ των 190 απομονώσεων ζυμομυκήτων που ταυτοποιήθηκαν, ο S. cerevisiae ήταν κυρίαρχος, ενώ μη συμβατικά non-Saccharomyces είδη, συμπεριλαμβανομένων των Trigonopsis californica, Priceomyces carsonii, Zygosaccharomyces bailii, Brettanomyces bruxellensis και Pichia manshurica, ανιχνεύθηκαν σε μικρότερες αναλογίες. Τα προαναφερθέντα μη συμβατικά είδη, non-Saccharomyces, θα εξεταστούν περαιτέρω στο κεφάλαιο 4. Η φαινοτυπική κατηγοριοποίηση αποκάλυψε τέσσερις διακριτές ομάδες ζυμομυκήτων, ενώ η ανάλυση σε επίπεδο στελέχους προσδιόρισε 20 διαφορετικά στελέχη S. cerevisiae. Επιπλέον, παρουσιάστηκε ένα στέλεχος S. cerevisiae (S6-A6Y10) με εξαιρετικές ικανότητες ζύμωσης το οποίο ανιχνεύθηκε και στις 4 γεωγραφικές περιοχές προέλευσης των δειγμάτων. Η οργανοληπτική ανάλυση επιβεβαίωσε σημαντικές διαφορές στους παραγόμενους οίνους, επικυρώνοντας την προτεινόμενη ταξινόμηση των ζυμών. Σε αυτό το κεφάλαιο προτείνεται μια νέα βιοστατιστική προσέγγιση για την ταχεία διαλογή και ταξινόμηση των γηγενών ζυμών οίνου, διευκολύνοντας την αποτελεσματική προκαταρκτική επιλογή. Όσον αφορά το κεφάλαιο 3, διερευνήθηκε η επίδραση τεσσάρων αυτόχθονων στελεχών S. cerevisiae (S6-A6Y6, S10-A6Y10, S20-A26Y5 και S14-K33Y14), που απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν στο Κεφάλαιο 2, στο οργανοληπτικό προφίλ οίνων της ποικιλίας «Ασύρτικο». Η αέρια χρωματογραφία-ολοφακτομετρία/φασματομετρία μάζας (GC-O/MS) προσδιόρισε τα αρωματικά ενεργά πτητικά συστατικά, ενώ οι πτητικές θειόλες ποσοτικοποιήθηκαν μέσω GC/MS και συσχετίστηκαν με τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το στέλεχος S. cerevisiae S10-A6Y10 συνέβαλε σε ένα σύνθετο αρωματικό προφίλ, ενώ το στέλεχος S. cerevisiae S14-K33Y14 εισήγαγε καπνιστές νότες ξύλου που συνδέονται με την παραγωγή φουρανεόλης. Όλα τα στελέχη ενίσχυσαν την παραγωγή πτητικών θειολών, με την 3-σουλφανυλοεξαν-1-όλη (3SH), την οξική 3SH (3SHA) και τη βενζενεμεθανοθειόλη (BM) να υπερβαίνουν τα αισθητηριακά όρια. Η μελέτη αυτή είναι η πρώτη που ενσωματώνει ποιοτικά και ποσοτικά δεδομένα για τη διάκριση του αρωματικού αποτυπώματος των οίνων Ασύρτικου με βάση αποκλειστικά το εμβόλιο ζύμωσης, αναδεικνύοντας τον σημαντικό ρόλο των γηγενών στελεχών S. cerevisiae στη διαμόρφωση του τελικού οργανοληπτικού προφίλ. Επιπλέον, στο κεφάλαιο 4, πέντε μη συμβατικοι non-Saccharomyces ζυμομύκητες ( Z. bailii, P. carsonii, T. californica και P. manshurica), οι οποίοι εντοπίστηκαν στο τελικό στάδιο αυθόρμητων ζυμώσεων (κεφάλαιο 2), αξιολογήθηκαν ως προς τις δυνατότητές τους στη ζύμωση λευκών οίνων της ποικιλίας «Ασύρτικο». Η κινητική της ζύμωσης, και η οργανοληπτική ανάλυση, χρησιμοποιήθηκε αρχικά για τον έλεγχο του οινολογικού δυναμικού όλων των υπό μελέτη στελεχών. Με βάση τις επιδόσεις τους, επιλέχθηκαν δύο στελέχη Z. bailii (Zb-A19Y5 και Zb-K29Y2) και ένα στέλεχος T. californica (Tc-A9Y1) για περαιτέρω ανάλυση. Το στέλεχος T. californica Tc-A9Y1 οδήγησε στην παραγωγή ξηρού οίνου με χαμηλότερη περιεκτικότητα σε αλκοόλη από τους άλλους πειραματικούς οίνους. Κανένας από τους οίνους δεν παρουσίασε ελατωματικά οργανολητπικά χαρακτηριστικά. Το στέλεχος Zb-A19Y5 παρουσίασε τις υψηλότερες βαθμολογίες σε διάφορα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, όπως είναι η αρωματική ένταση, η φρουτώδης γεύση, τα εσπεριδοειδή, η οξύτητα και η αρωματική επίγευση. Τα αποτελέσματα αναδεικνύουν τις δυνατότητες νέων non-Saccharomyces στελεχών στην παραγωγή οίνων υψηλής ποιότητας με ταυτόχρονη προσαρμογή στις συνθήκες υπερθέρμανσης του πλανήτη, παρουσιάζοντας νέες ευκαιρίες για την αμπελουργία.Το κεφάλαιο 5 επικεντρώνεται στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των επιλεγμένων γηγενών στελεχών Z. bailii και S. cerevisiae από τα Κεφάλαια 3 και 4, σε μόνο- και συγ-καλλιέργειες σε περιβάλλον οινοποίησης. Γνώμονας είναι η επίδρασή των διαφορετικών εμβολίων στην κινητική της ζύμωσης, στη δυναμική των μικροβιακών πλυθησμών και στο τελικό αρωματικό προφίλ του οίνου. Σε ένα αρχικό πείραμα ζύμωσης, εισήχθησαν τόσο καθαρές όσο και μικτές καλλιέργειες του Z. bailii Zb-A19Y5 και δύο στελεχών S. cerevisiae (S6-A6Y10 και S10-K33Y14), με την κινητική της ζύμωσης και τη δυναμική του πληθυσμού να παρακολουθούνται στενά. Για να εκτιμηθεί ο αντίκτυπος των διαφορετικών μεθόδων εμβολιασμού, το πιο αποτελεσματικό στέλεχος S. cerevisiae (S10-A6Y10) επιλέχθηκε για τη διεξαγωγή περαιτέρω εργαστηριακών ζυμώσεων, συγκρίνοντας τον διαδοχικό, τον ταυτόχρονο συνεμβολιασμό με τον Z. bailii και τις μονοκαλλιέργειες των δύο ειδών. Το κεφάλαιο αυτό έδωσε έμφαση στην κινητική των ζυμώσεων, στις μικροβιακές αλληλεπιδράσεις και στα οινολογικά χαρακτηριστικά. Η αρωματική σύνθεση του οίνου προσδιορίστηκε με τη χρήση GC-MS, ενώ η αισθητηριαική ανάλυση παρείχε μια συνολική αξιολόγηση των επιπτώσεων των στρατηγικών εμβολιασμού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι μικτές καλλιέργειες Z. bailii και S. cerevisiae επιτάχυναν τη ζύμωση και προώθησαν την ανάπτυξη του Z. bailii, υποδηλώνοντας μια συνεργατική αλληλεπίδραση. Επιπλέον, το στέλεχος Zb-A19Y5 παρουσίασε ενδιαφέροντα οινολογικά χαρακτηριστικά, όπως είναι η αντοχή στην παραγώμενη αλκοόλη, φρουκτόφιλο χαρακτήρα, κατανάλωση μηλικού οξέος και απελευθέρωσης ποικιλιακών θειολών. Συνοψίζοντας, ο συνεμβολιασμός αναδείχθηκε ως η πιο αποτελεσματική μέθοδος, οδηγώντας στην παραγωγή οίνων με αυξημένα χαρακτηριστικά εσπεριδοιειδών, passion fruit και ανθικών αρωμάτων.