Προσδιορισμός και συσχέτιση αλληλόμορφων γονιδίων και γονοτύπων με αναπαραγωγικές παραμέτρους σε αυτόχθονες φυλές προβάτων

Abstract

Sheep farming is crucial for Mediterranean countries, such as Greece, which produce a wealth of dairy products. However, many indigenous sheep breeds in temperate latitudes such as the Mediterranean have a serious disadvantage, as milk production is affected by the seasonality of reproduction. In sheep, seasonality describes reproductive cycles that occur throughout the year. Sheep breed when day length is short, as the amount of light they receive has an impact on their reproductive activity. In an attempt to reduce the use of exogenous hormone administration to induce estrus, genetic improvement aimed at achieving non-seasonal breeding could offer a promising alternative. The melatonin receptor subtype 1A (MNTR1A) gene appears to be the main gene associated with seasonality in sheep.Τo reduce this phenomenon, the aim of this study was to evaluate and compare different methods of estrus synchronization, as well as to correlate two gene alleles, namely MTNR1A and GDF9, with the response to these methods. Three indigenous sheep breeds (Florina, Chios and Karagouniko) were investigated and within each breed three different methods of estrus synchronization were applied (A: intravaginal sponges, B: use of GNRH and C: male effect). In group A, Florina ewes expressed 90% estrus in July and fertility was 85%. Karagouniko and Chios ewes showed 100% estrus expression with fertility rates of 95% and 99%, respectively. In group B, Florina ewes expressed estrus at 60% with fertility at 57%, Karagouniko ewes expressed estrus at 65% with fertility at 54%, while Chios animals expressed estrus at 87% with fertility at 85%. In group C, 68% of Florina expressed estrus 20-25 days after the introduction of rams, while this percentage was 84% and 94%, for Karagouniko and Chios, respectively. For molecular analysis, some parts of the two genes were sequenced and analyzed, while the alleles were scored based on the detected SNPs. All frequencies of the four SNPs detected in the MTNR1A gene were statistically and significantly different in ewes that expressed estrus compared to ewes that did not express estrus in the Florina and Karagouniko breeds in all methods. Two SNPs were detected in the GDF9 gene, G1 and FecG, of which only the FecG mutation showed a statistically significant difference in twins and triplets compared to singles in the Florina and Karagouniko breeds.However, information on the relationship between other genetic loci and seasonality of sheep breeding is lacking. Genome Wide Association Studies (GWAS) are considered a cutting-edge method for understanding the genetic architecture of complex traits, as they allow the discovery of multiple markers associated with different aspects. Despite the great role of the MTNR1A gene being the primary factor that determines the seasonality of Greek sheep breeds, several other SNPs were potentially associated with this complex trait. The location of these genetic loci, in line with previous studies, demonstrates the high complexity of seasonality of reproduction in sheep, influenced by various physiological functions. More importantly, from a marker-assisted selection point of view towards genetic improvement for seasonality in the reproduction reduction in sheep, it is inferred that different genetic loci may enact different roles in breeds from different regions. Nevertheless, overall, the melatonin receptor subtype 1A gene (MTNR1A) appears to be the main determinant of seasonality in indigenous sheep breeds, according to GWAS data. The current findings also highlighted the critical role of the Greek research station in maintaining the genetic integrity and conservation of indigenous sheep breeds.

Η εκτροφή προβάτων διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο για τις μεσογειακές χώρες, όπως η Ελλάδα, από τις οποίες παράγεται πληθώρα γαλακτοκομικών προϊόντων. Ωστόσο, πολλές αυτόχθονες φυλές προβάτων σε εύκρατα γεωγραφικά πλάτη όπως η Μεσόγειος παρουσιάζουν ένα σοβαρό μειονέκτημα καθώς η παραγωγή γάλακτος επηρεάζεται από την εποχικότητα της αναπαραγωγής. Στα πρόβατα, η εποχικότητα αναφέρεται στους αναπαραγωγικούς κύκλους που λαμβάνουν χώρα καθ' όλη τη διάρκεια του έτους. Τα πρόβατα αναπαράγονται όταν η διάρκεια της ημέρας είναι μικρή, καθώς η ποσότητα του φωτός που προσλαμβάνουν έχει αντίκτυπο στην αναπαραγωγική τους δραστηριότητα. Σε μια προσπάθεια να μειωθεί η χρήση της χορήγησης εξωγενών ορμονών για την πρόκληση οίστρου, η γενετική βελτίωση με στόχο την επίτευξη μη εποχικής αναπαραγωγής θα μπορούσε να προσφέρει μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική λύση. Το γονίδιο του υποτύπου 1A (MNTR1A) του υποδοχέα μελατονίνης έχει προταθεί ως το κύριο γονίδιο που συνδέεται με την εποχικότητα των προβάτων. Με απώτερο στόχο τις προσπάθειες μείωσης αυτού του φαινομένου, σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογήσει και να συγκρίνει διαφορετικές μεθόδους συγχρονισμού οίστρου, καθώς και να συσχετίσει δύο γονίδια, δηλαδή το MTNR1A και το GDF9, με την ανταπόκριση σε αυτές τις μεθόδους. Ερευνήθηκαν τρεις αυτόχθονες φυλές προβάτων (Φλώρινας, Χίου και Καραγκούνικο) και μέσα σε κάθε φυλή εφαρμόστηκαν τρεις διαφορετικές μέθοδοι συγχρονισμού οίστρου (Α: ενδοκολπικοί σπόγγοι, Β: χρήση GNRH και Γ: επίδραση αρσενικού). Στην ομάδα Α, οι προβατίνες Φλώρινας εξέφρασαν οίστρο 90% τον Ιούλιο και η γονιμότητα ήταν 85%. Οι προβατίνες Καραγκούνικο και Χίου εμφάνισαν οίστρο 100% με ποσοστά γονιμότητας 95% και 99%, αντίστοιχα. Στην ομάδα Β, οι προβατίνες Φλώρινας εξέφρασαν οίστρο στο 60% με γονιμότητα στο 57%, οι προβατίνες Καραγκούνικο εξέφρασαν οίστρο στο 65% με γονιμότητα στο 54%, ενώ τα ζώα της φυλής Χίου εξέφρασαν οίστρο στο 87% με ποσοστό γονιμότητας στο 85%. Στην ομάδα Γ, το 68% της φυλής Φλώρινας εξέφρασε οίστρο 20-25 ημέρες μετά την εισαγωγή των κριών, ενώ το ποσοστό αυτό ήταν 84% και 94%, για τη φυλή Καραγκούνικο και Χίο, αντίστοιχα. Για τη μοριακή ανάλυση, τμήματα των δύο γονιδίων αλληλουχήθηκαν και αναλύθηκαν, ενώ τα αλληλόμορφα βαθμολογήθηκαν με βάση τα ανιχνευμένα SNPs. Όλες οι συχνότητες των τεσσάρων SNPs που ανιχνεύθηκαν στο γονίδιο MTNR1A ήταν στατιστικά και σημαντικά διαφορετικές στις προβατίνες που εξέφρασαν οίστρο σε σύγκριση με τις προβατίνες που δεν εξέφρασαν οίστρο στις φυλές Φλώρινας και Καραγκούνικο σε όλες τις μεθόδους. Στο γονίδιο GDF9 ανιχνεύθηκαν δύο SNPs, τα G1 και FecG, από τα οποία μόνο η μετάλλαξη FecG εμφάνισε στατιστικά σημαντική διαφορά στα δίδυμα και τρίδυμα απ' ότι στα μονόδυμα στις φυλές Φλώρινας και Καραγκούνικο.Ωστόσο, καθώς είναι ελλιπείς οι πληροφορίες σχετικά με τη σχέση μεταξύ άλλων γενετικών τόπων και την εποχικότητα της αναπαραγωγής των προβάτων, τα φαινόμενα αυτά διερευνήθηκαν και σε επίπεδο γονιδιώματος. Οι μελέτες Συσχέτισης σε Επίπεδο Γονιδιώματος (Genome Wide Association Studies, GWAS) θεωρούνται μια μέθοδος αιχμής για την κατανόηση της γενετικής αρχιτεκτονικής σύνθετων χαρακτηριστικών, καθώς επιτρέπουν την ανακάλυψη πολλών δεικτών που συνδέονται με διαφορετικές πτυχές. Παρά τον σημαντικό ρόλο του γονιδίου MTNR1A που αποτελεί τον πρωταρχικό παράγοντα που καθορίζει την εποχικότητα των ελληνικών φυλών προβάτων, αρκετά άλλα SNPs πιθανώς συσχετίστηκαν με αυτό το σύνθετο χαρακτηριστικό. Η θέση αυτών των γενετικών τόπων, σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, καταδεικνύει την υψηλή πολυπλοκότητα της εποχικότητας της αναπαραγωγής στα πρόβατα, η οποία επηρεάζεται από διάφορες φυσιολογικές λειτουργίες. Το πιο σημαντικό είναι ότι, από την άποψη της επιλογής με τη βοήθεια δεικτών προς τη γενετική βελτίωση της εποχικότητας στη μείωση της αναπαραγωγής στα πρόβατα, συνάγεται ότι διαφορετικοί γενετικοί τόποι μπορούν να διαδραματίζουν διαφορετικούς ρόλους σε φυλές από διαφορετικές περιοχές. Ωστόσο, το γονίδιο του υποτύπου 1Α του υποδοχέα μελατονίνης (MTNR1A) φαίνεται να είναι ο κύριος καθοριστικός παράγοντας της εποχικότητας των αυτόχθονων φυλών προβάτων, σύμφωνα με τα στοιχεία της GWAS. Τα τρέχοντα ευρήματα κατέδειξαν επίσης τον κρίσιμο ρόλο του ελληνικού ερευνητικού σταθμού στη διατήρηση της γενετικής ακεραιότητας και διατήρησης των αυτόχθονων φυλών προβάτων.