Εξερεύνηση νέων αντιμικροβιακών μορίων εκτός του γνωστού χημικού χώρου (chemical space)

Abstract

The extensive use of antibiotics in clinical practice has contributed to the development of bacteria resistant to a wide range of antimicrobials, leading to an annual increase in global mortality due to infections. The aim of this PhD thesis is to discover new molecules in response to the urgent need to find new therapeutic solutions. The combination of Microbiology with Bioinformatics and Chemopolymerformatics tools will allow the expansion of the discovery and analysis of organic molecules from the entire spectrum of the chemical space with the aim of attempting to build libraries of chemical molecules with antimicrobial activity for the inhibition of multiple targets against the bacterial cell. The novelty of this thesis lies in the way of approaching the process of searching for compounds with antimicrobial activity hoping to access resistance mechanisms as it extends beyond the known chemical space of antimicrobials. The experimental procedure will include: 1. selection of bacterial targets and reference compounds; 2. in silico experiments of the selected molecules; 3. chemical library generation; and 4. in vitro testing of the antimicrobial activity of the selected molecules; feedback and optimization of the experimental design. Through an integrated approach combining bioinformatics, chemoinformatics and experimental biology, we tested a library of chemical compounds. Our results showed that derivatives of curcumin, compounds from the NCI chemistry library, as well as derivatives of hydroxytyrosol belonging to the Pharmalab chemistry library, exhibited interesting antimicrobial activity against a wide range of pathogenic bacteria. Particular activity was shown by CCM2 and CCM9 which were identified as the most active compounds as concluded from the present study. Mechanistically, these compounds appear to act through multiple mechanisms. Disruption of the bacterial membrane, induction of oxidative stress and interaction with bacterial DNA were identified as key mechanisms of action. In particular, CCM9 proved to be highly effective in inducing oxidative stress, while CCM2 showed high affinity for bacterial DNA. In vivo studies confirmed the antimicrobial activity of these compounds, particularly CCM2. However, CCM9 exhibited cardiotoxicity in a zebrafish model, highlighting the need for further toxicity studies. Our findings suggest that the curcumin derivatives studied are promising candidates for the development of new antibiotics. The complexity of their mechanisms of action, combined with their broad-spectrum antimicrobial activity, suggests that these compounds may be an effective response to the growing challenge of antimicrobial resistance. However, further preclinical and clinical studies are required to fully evaluate their therapeutic potential and to optimise their pharmacokinetic profile.

Η εκτεταμένη χρήση αντιβιοτικών στην κλινική πράξη συνέβαλε στην ανάπτυξη ανθεκτικών βακτηρίων σε ευρύ φάσμα αντιμικροβιακών, οδηγώντας ετησίως στην αύξηση της παγκόσμιας θνησιμότητας λόγω λοιμώξεων. Σκοπός της διδακτορικής διατριβής είναι η ανακάλυψη νέων μορίων ως απάντηση στην επιτακτική ανάγκη εύρεσης νέων θεραπευτικών λύσεων. Ο συνδυασμός της Μικροβιολογίας με εργαλεία Βιοπληροφορικής και Χημειοπληροφορικής θα επιτρέψει την επέκταση της εύρεσης και ανάλυσης οργανικών μορίων από όλο το φάσμα του χημικού χώρου έχοντας ως στόχο την προσπάθεια κατάρτισης βιβλιοθηκών χημικών μορίων με αντιμικροβιακή δράση για την αναστολή πολλαπλών στόχων έναντι του βακτηριακού κυττάρου. Η καινοτομία της παρούσας διατριβής έγκειται στον τρόπο προσέγγισης της διαδικασίας αναζήτησης ουσιών με αντιμικροβιακή δράση ευελπιστώντας να προσπελάσει τους μηχανισμούς αντοχής καθώς επεκτείνεται πέρα από τον γνωστό χημικό χώρο των αντιμικροβιακών. Η πειραματική διαδικασία θα περιλαμβάνει: 1. επιλογή βακτηριακών στόχων και ενώσεων αναφοράς, 2. in silico πειράματα των επιλεγμένων μορίων, 3. δημιουργία χημικής βιβλιοθήκης και 4. in vitro έλεγχο της αντιμικροβιακής δράσης των επιλεγμένων μορίων-ανατροφοδότηση και βελτιστοποίηση του πειραματικού σχεδιασμού. Μέσω μιας ολοκληρωμένης προσέγγισης που συνδυάζει βιοπληροφορική, χημειοπληροφορική και πειραματική βιολογία, εξετάσαμε μια βιβλιοθήκη χημικών ενώσεων. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι παράγωγα της κουρκουμίνης, ενώσεις απο την NCI χημειοθήκη, καθώς και παράγωγα της υδροξυτυροσόλης που υπάγονται στην Pharmalab χημειοθήκη, παρουσίασαν ενδιαφέρουσα αντιμικροβιακή δράση ενάντια σε ένα ευρύ φάσμα παθογόνων βακτηρίων. Ιδιαίτερη δραστικότητα εμφάνισαν η CCM2 και η CCM9 που ορίστηκαν ως οι πλέον δραστικές ενώσεις όπως προέκυψε από την παρούσα μελέτη. Μηχανιστικά, οι ενώσεις αυτές φαίνεται να δρουν μέσω πολλαπλών μηχανισμών. Η διαταραχή της βακτηριακής μεμβράνης, η πρόκληση οξειδωτικού στρες και η αλληλεπίδραση με το βακτηριακό DNA αναγνωρίστηκαν ως βασικοί μηχανισμοί δράσης. Ειδικότερα, η CCM9 αποδείχθηκε ιδιαίτερα αποτελεσματική στην πρόκληση οξειδωτικού στρες, ενώ η CCM2 παρουσίασε υψηλή συγγένεια για το βακτηριακό DNA. In vivo μελέτες επιβεβαίωσαν την αντιμικροβιακή δράση των ενώσεων αυτών, ιδιαίτερα της CCM2. Ωστόσο, η CCM9 παρουσίασε καρδιοτοξικότητα σε zebrafish μοντέλο, υπογραμμίζοντας την ανάγκη για περαιτέρω μελέτες τοξικότητας. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι τα παράγωγα της κουρκουμίνης που μελετήθηκαν αποτελούν υποσχόμενους υποψηφίους για την ανάπτυξη νέων αντιβιοτικών. Η πολυπλοκότητα των μηχανισμών δράσης τους, σε συνδυασμό με την ευρέως φάσματος αντιμικροβιακή δράση, υποδηλώνει ότι οι ενώσεις αυτές μπορεί να αποτελέσουν αποτελεσματική απάντηση στην αυξανόμενη πρόκληση της αντιμικροβιακής αντοχής. Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω προκλινικές και κλινικές μελέτες για να αξιολογηθεί πλήρως το θεραπευτικό τους δυναμικό και να βελτιστοποιηθεί το φαρμακοκινητικό τους προφίλ.