Διερεύνηση της συσχέτισης της βακτηριδιακής υπερανάπτυξης του λεπτού εντέρου και των επιπέδων των ανοσοσφαιρινών του ορού με τον ελαστογραφικά εκτιμώμενο βαθμό ηπατικής ίνωσης σε ασθενείς με χρόνιες ηπατοπάθειες καιμε την κλινική έκβαση των ασθενών με κίρρωση του ήπατος

Abstract

Title: “Investigation of the relationship between small intestinal bacterial overgrowth(SIBO) and the levels of serum immunoglobulins with the grade of hepatic fibrosis evaluated by elastography in patients with chronic liver disease and the clinical outcome in patients with cirrhosis ”Backgound: Liver cirrhosis has been associated with small intestinal bacterial overgrowth (SIBO)and translocation of bacteria and their products, such as lipopolysaccharide, into portal and systemic circulation triggering the production of proinflammatory cytokines such as tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6). The systemic inflammatory reaction plays an important role in the occurrence of complications of while portal hypertension while it has been associated with the pathogenesis and progression of liver fibrosis in patients with chronic liver disease (CLD) such as alcoholic liver disease (ALD), viral hepatitis, and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). In addition, the reduced clearance of intestinal bacterial antigens from liver Kupffer cells and hepatic stellate cells and their presence in the systemic circulation leads to polyclonal activation of B lymphocytes and the production of immunoglobulins. In particular, serum levels of IgG and IgA have been linked to higher grades of fibrosis inpatients with CLD. Objective: We investigated the occurrence of SIBO and its relationship with levels, markers of systemic inflammatory activity and the grade of hepatic fibrosis evaluated by elastography in patients with cirrhosis and CLD without cirrhosis due to ALD, viral hepatitis, and NAFLD. In addition, the impact of SIBO on the clinical outcome of patients with cirrhosis was assessed. Methods: We studied patients with CLD due to ALD, viral hepatitis (HBV with detectable HBVDNA and HCV), and NAFLD (with moderate-severe steatosis) who were seen in outpatient liver clinics of first division of Internal Medicine, University Hospital of Ioannina, Greece from May 2017 to May 2021. The patients were followed until liver transplantation, death or May 2024. Four groups of patients with CLD and one group of healthy volunteers were evaluated. One CLD-group included patients with cirrhosis and the other three patients without established cirrhosis. The diagnosis of ALD, viral hepatitis B and C, and NAFLD was based on current criteria. Decompensation inpatients with cirrhosis was defined as the presence of ascites, variceal bleeding or hepatic encephalopathy. We measured serum levels of IgG, IgA and IgM and evaluated markers of systemic inflammatory activity. As markers of systemic inflammation were considered the immunoglobulins and the serum levels of lipopolysaccharide-binding protein (LBP) measured with ELISA and serum levels of TNF-α and IL-6 measured with cytometry flow in the subgroup of patients with cirrhosis and ascites. SIBO was evaluated by hydrogen breath test after the administration of lactulose. We measured liver stiffness (LS) by shear wave elastography in all patients and healthy volunteers within a week after the performance of hydrogen breath test. We considered SIBO tobe present when there was an increase in breath hydrogen (peak concentration of exhaled hydrogen [PCEH]) of at least 20 ppm above the baseline value within 90 min. Spearman’s test was used for correlation of the variables of the study. The incidence of liver-related death according to the presence of SIBO was estimated using Kaplan-Meier analysis and differences were compared by the log rank test. A p value of <0.05was considered statistically significant. Results: The study included 115 patients with cirrhosis (80 with [69.5%] with ascites),108 patients with CLD (35 with ALD, 32 with chronic hepatitis [Β in 25 and C in 7] and41 with NAFLD) and 15 healthy volunteers. The occurrence of SIBO was significantly higher in patients with cirrhosis (78/115 [67.8%]) compared to those with CLD without cirrhosis in total (12/108 [11.1%%]), ALD (5/35 [14.2%]), chronic hepatitis (3/32[9.3%]), NAFLD (4/41 [9.7%]) and healthy volunteers (1/15 [6.6%]) (p<0.001 for all comparisons). The levels of IgG were significantly higher in patients with cirrhosis(1455±45 mg/dl) compared to those with CLD without cirrhosis in total (1134±38mg/dl), ALD (1152±32 mg/dl), chronic hepatitis (1102±39 mg/dl), NAFLD (1164±47mg/dl) and healthy volunteers (1094±28 mg/dl) (p<0.001 for all comparisons). The proportion of SIBO and the levels of all immunoglobulins were similar in CLD-groups without cirrhosis and healthy volunteers. The values of LS were significantly higher inpatients with cirrhosis (21.4±1 kPa) compared to those with to those with CLD without cirrhosis in total (6.8±0.6 kPa), ALD (7±0.8 kPa), chronic hepatitis (6.4±0.5 kPa), NAFLD(6.6±0.7 kPa) and healthy volunteers (4.3±0.2 kPa) (p<0.001 for all comparisons). LS was similar in CLD-groups without cirrhosis and healthy volunteers. No differences were noted in immunoglobulin levels and LS in CLD-groups without cirrhosis among patients with and without SIBO. Patients with cirrhosis and SIBO compared to those without SIBO had more advanced liver disease (Child-Pugh A/B/C: 17/38/10 vs30/16/4, p=0.001) and significantly higher proportion of ascites (90.6% έναντι 43.1%,p<0.001) and serum levels of IgG (1563±48 vs 1325±46 mg/dl, p=0.001) while the levels of IgΑ and IgΜ did not differ. The LS was significantly higher in patients with cirrhosis and SIBO compared to those without SIBO (25.8±0.9 vs 21±0.8 kPa, p=0.01).Among patients with cirrhosis and SIBO, the values of LS correlated significantly with the PCEH (r=0.395;p=0.001) and the IgG levels (r=0.462;p<0.001). The PCEH also correlated with the IgG levels (r=0.285;p=0.02). No significant correlations were noted in patients with cirrhosis without SIBO. SIBO was diagnosed in 58 (72.5%) patients with cirrhosis and ascites. The patients with ascites and SIBO had significantly higher levels of LBP (7.28±0.1 vs. 6.32±0.15 ng/mL; p<0.001) and IgG (1612±46 vs. 1377±52mg/dl, p=0.008) compared to those without SIBO. No significant differences were noted in the levels of other inflammatory markers and serum immunoglobulins among patients with and without SIBO. In patients with ascites and SIBO, the LS correlated significantly with PCEH (r=0.370;p=0.004), LBP (r=0.678; P<0.001) and IgG levels(r=0.483;p=0.009). LBP levels also correlated with LS (r=0.315;p=0.01) in these patients. No significant correlations were noted in patients without SIBO. During follow-up (35.7±1.8 months), the occurrence of decompensation/new decompensation was significantly higher in patients with SIBO compared to those without SIBO: 33/64 (51.5%) έναντι 16/56 (28.5%), p=0.01 including a higher occurrence or recurrence of ascites (21/64 [32.8%] vs. 10/56 [17.8%], p=0.06) and hepatic encephalopathy (8/64 [12.5%] vs. 2/56 [3.5%], p=0.07). The proportion of deaths was significantly higher in patients with SIBO compared to those without SIBO(19/64 [29.6%] vs. 8/56 [14.2%], p=0.04). The 5-year survival was significantly lower inpatients with SIBO than in those without SIBO (56.1% vs. 80.4%, p=0.03).Conclusions: The patients with cirrhosis due to ALD, viral hepatitis, and NAFLD, mainly those with ascites, presented higher occurrence of SIBO, which increased proportionally with the severity of cirrhosis. SIBO in patients with cirrhosis, and particularly those with ascites, was significantly related with higher IgG levels, inflammatory activity, and grade of liver fibrosis as estimated by LS. In patients with cirrhosis, SIBO was associated with worse clinical outcomes including a higher occurrence of portal hypertension complications and reduced survival. In patients with CLD without cirrhosis, the incidence of SIBO, immunoglobulin levels and LS were significantly lower than in patients with cirrhosis and similar to patients without CLD.

Τίτλος: «Διερεύνηση της συσχέτισης της βακτηριδιακής υπερανάπτυξης του λεπτού εντέρου και των επιπέδων των ανοσοσφαιρινών του ορού με τον ελαστογραφικά εκτιμώμενο βαθμό ηπατικής ίνωσης σε ασθενείς με χρόνιες ηπατοπάθειες και με την κλινική έκβαση των ασθενών με κίρρωση του ήπατος» Ιστορικό: Η κίρρωση του ήπατος έχει συνδεθεί με βακτηριακή υπερανάπτυξη του λεπτού εντέρου (ΒΥΛΕ) και αλλόθεση των βακτηρίων και των δομικών συστατικών τους, όπως το λιποπολυσακχαρίδιο, στην πυλαία και συστηματική κυκλοφορία με αποτέλεσμα την διέγερση παραγωγής προφλεγμονωδών κυτταροκινών, όπωςπ αράγοντα νέκρωσης όγκου-α (tumor necrosis factor-α [TNF-α]) και ιντερευκίνη-6(interleukin-6 [IL-6]. Η συστηματική φλεγμονώδης απάντηση φαίνεται αφενός να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στις κλινικές εκδηλώσεις της κίρρωσης μέσω επιδείνωσης της πυλαίας υπέρτασης ενώ αφετέρου έχει σχετιστεί με την παθογένεση και την εξέλιξη της ηπατικής ίνωσης σε ασθενείς με χρόνια ηπατική νόσο (ΧΗΝ) όπως η αλκοολική νόσος του ήπατος (ΑΛΝΗ), οι χρόνιες ιογενείς ηπατίτιδες και η μη αλκοολική λιπώδης νόσος του ήπατος (ΜΑΛΝΗ). Επιπρόσθετα, η μειωμένη κάθαρση των εντερικών βακτηριακών αντιγόνων από τα κύτταρα Kupffer του ήπατος και η παρουσία τους στην συστηματική κυκλοφορία οδηγεί στην πολυκλωνική ενεργοποίηση των Β λεμφοκυττάρων και την παραγωγή ανοσοσφαιρινών. Τα επίπεδατων IgG και IgA έχουν μάλιστα σχετιστεί με την βαρύτητα της ηπατικής ίνωσης σε ασθενείς με ΧΗΝ. Στόχος: Διερευνήθηκε η παρουσία της ΒΥΛΕ και η συσχέτισή της με τις ανοσοσφαιρίνες ορού, δείκτες της συστηματικής φλεγμονώδους δραστηριότητας και τον ελαστογραφικά εκτιμώμενο βαθμό ηπατικής σκληρίας σε ασθενείς με κίρρωση και ΧΗΝ χωρίς εγκατεστημένη κίρρωση λόγω ΑΛΝΗ, χρόνιων ιογενών ηπατιτίδων Β και C και ΜΑΛΝΗ. Επίσης εκτιμήθηκε ο ρόλος της ΒΥΛΕ στην κλινική έκβαση των ασθενών με ΒΥΛΕ. Μέθοδοι: Μελετήθηκαν ασθενείς με ΧΗΝ λόγω ΑΛΝΗ, χρόνιας ιογενούς ηπατίτιδας (Β με ιστορικό ανιχνεύσιμου HBVDNA και C) και ΜΑΛΝΗ (με μέτρια και σοβαρή στεάτωση) οι οποίοι παρακολουθούνταν στο Εξωτερικό Ηπατολογικό Ιατρείο της Α’ Παθολογικής Κλινικής του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ιωαννίνων. Η μελέτη διήρκεσε από το Μάιο του 2017 έως το Μάιο του 2021. Οι ασθενείς παρακολουθούνταν έως τη μεταμόσχευση ήπατος, το θάνατο ή τον Μάιο του 2024. Μελετήθηκαν 4 ομάδες ασθενών με ΧΗΝ και 1 ομάδα υγιών εθελοντών. Η μία ομάδα ασθενών συμπεριέλαβε ασθενείς με εγκατεστημένη κίρρωση του ήπατος λόγω οποιασδήποτε από τις ανωτέρω αιτιολογίες και οι άλλες 3 ασθενείς χωρίς κίρρωση. Η διάγνωση της ΑΛΝΗ, των ιογενών ηπατιτίδων και της ΜΑΛΝΗ βασίστηκε σε διεθνή κριτήρια. Η ρήξη αντιρρόπησης στους ασθενείς με κίρρωση βασίστηκε στο ιστορικό κλινικά εμφανούς ασκίτη, κιρσορραγίας ή ηπατικής εγκεφαλοπάθειας. Πραγματοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισμός των ανοσοσφαιρινών IgG, IgA και IgM στον ορό με νεφελομετρία και εκτίμηση δεικτών της συστηματικής φλεγμονώδους δραστηριότητας. Ως δείκτες της φλεγμονώδους δραστηριότητας εξετάστηκαν οιανοσοσφαιρίνες ορού στο σύνολο των ασθενών της μελέτης και επιπροσθέτως η δεσμευτική πρωτείνη του λιποπολυσακχαριδίου (lipopolysaccharide-binding protein[LBP]) ορού με ELISA και κυτταροκίνες όπως ο TNF-α και η IL-6 στον ορό με κυτταρομετρία ροής στους ασθενείς με κίρρωση και ασκίτη. Η ΒΥΛΕ εκτιμήθηκε με την δοκιμασία εκπνοής υδρογόνου μετά τη χορήγηση λακτουλόζης και πραγματοποιήθηκε μετά την αιμοληψία. Σε όλους τους ασθενείς και τους υγιείς εθελοντές πραγματοποιήθηκε μέτρηση της ηπατικής σκληρίας ως δείκτη της ηπατικής ίνωσης εντός μίας εβδομάδας από την δοκιμασία εκπνοής υδρογόνου HBT με ελαστογραφία διατμητικών κυμάτων (shear wave elastography). Μια μέτρηση εκπνεόμενου υδρογόνου >20 ppm στα πρώτα 90 λεπτά της μέτρησης θεωρήθηκε διαγνωστική για ΒΥΛΕ. Η δοκιμασία Spearman χρησιμοποιήθηκε για τις συσχετίσεις των μεταβλητών της μελέτης. Η επιβίωση των ασθενών με κίρρωση σύμφωνα με την ύπαρξη της ΒΥΛΕ εκτιμήθηκε με την καμπύλη Kaplan-Meier και οι διαφορές συγκρίθηκαν με το log rank test. Η τιμή p<0.05 θεωρήθηκε σημαντική για όλες τις αναλύσεις. Αποτελέσματα: Μελετήθηκαν 115 ασθενείς με κίρρωση (80 [69.5%] με ασκίτη), 108 ασθενείς με ΧΗΝ χωρίς κίρρωση (35 με ΑΛΝΗ, 32 με χρόνια ηπατίτιδα [Β σε 25 και Cσε 7] και 41 με ΜΑΛΝΗ) και 15 υγιείς εθελοντές. Το ποσοστό της ΒΥΛΕ ήταν σημαντικά υψηλότερο στους ασθενείς με κίρρωση (78/115 [67.8%]) έναντι αυτών με ΧΗΝ χωρίς κίρρωση συνολικά (12/108 [11.1%%]), ΑΛΝΗ (5/35 [14.2%]), χρόνια ιογενή ηπατίτιδα(3/32 [9.3%]), ΜΑΛΝΗ (4/41 [9.7%]) και των υγιών εθελοντών (1/15 [6.6%]) (p<0.001για όλες τις συγκρίσεις). Οι τιμές της ανοσοσφαιρίνης IgG ήταν σημαντικά υψηλότερες στους ασθενείς με κίρρωση (1455±45 mg/dl) έναντι αυτών με ΧΗΝ χωρίς κίρρωση συνολικά (1134±38 mg/dl), ΑΛΝΗ (1152±32 mg/dl), χρόνια ιογενή ηπατίτιδα (1102±39 mg/dl), ΜΑΛΝΗ (1164±47 mg/dl) και των υγιών εθελοντών (1094±28 mg/dl)(P<0.001 για όλες τις συγκρίσεις) ενώ δεν σημειώθηκαν διαφορές στις τιμές των άλλων ανοσοσφαιρινών. Τo ποσοστό της ΒΥΛΕ και τα επίπεδα όλων των ανοσοσφαιρινών ήταν παρόμοια στις ομάδες των ασθενών με ΧΗΝ χωρίς κίρρωση και τους υγιείς εθελοντές. Οι τιμές της ηπατικής σκληρίας ήταν σημαντικά υψηλότερες στους ασθενείς με κίρρωση (21.4±1 kPa) έναντι αυτών με ΧΗΝ χωρίς κίρρωση συνολικά (6.8±0.6 kPa), ΑΛΝΗ (7±0.8 kPa), χρόνια ιογενή ηπατίτιδα (6.4±0.5 kPa), ΜΑΛΝΗ (6.6±0.7 kPa) και των υγιών εθελοντών (4.3±0.2 kPa) (p<0.001 για όλες τις συγκρίσεις). Η ηπατική σκληρία ήταν παρόμοια στις ομάδες των ασθενών με ΧΗΝ χωρίς κίρρωση και τους υγιείς εθελοντές. Δεν σημειώθηκαν διαφορές στις τιμές των ανοσοσφαιρινών και της ηπατικής σκληρίας στις ομάδες των ασθενών με ΧΗΝ χωρίς κίρρωση μεταξύ αυτών με ΒΥΛΕ και αυτών χωρίς ΒΥΛΕ. Οι ασθενείς με κίρρωση και ΒΥΛΕ συγκριτικά με αυτούς χωρίς ΒΥΛΕ είχαν μεγαλύτερη βαρύτητα κίρρωσης (Child-Pugh A/B/C: 17/38/10 έναντι 30/16/4, p=0.001) και σημαντικά μεγαλύτερο ποσοστό ασκίτη (90.6% έναντι 43.1%, p<0.001) και σημαντικά υψηλότερα επίπεδα IgG ορού(1563±48 έναντι 1325±46 mg/dl, p=0.001) ενώ οι τιμές IgΑ και IgΜ ορού δεν διέφεραν σημαντικά. Η ηπατική σκληρία ήταν σημαντικά υψηλότερη στους ασθενείς με κίρρωση και ΒΥΛΕ έναντι αυτών χωρίς ΒΥΛΕ (25.8±0.9 έναντι 21±0.8 kPa, p=0.01).Μεταξύ των ασθενών με κίρρωση και ΒΥΛΕ, οι τιμές της ηπατικής σκληρίας συσχετίστηκαν σημαντικά με τη μέγιστη συγκέντρωση του εκπνεόμενου υδρογόνου(r=0.395;p=0.001) και με τις τιμές IgG ορού (r=0.462;p<0.001). Η μέγιστη συγκέντρωση του εκπνεόμενου υδρογόνου συσχετίστηκε επίσης σημαντικά με τις τιμές IgG ορού (r=0.285;p=0.02). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές συσχετίσεις στους ασθενείς με κίρρωση χωρίς ΒΥΛΕ. ΒΥΛΕ διαγνώστηκε σε 58 (72.5%) ασθενείς με κίρρωση και ασκίτη. Οι ασθενείς με ασκίτη και ΒΥΛΕ είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα LBP (7.28±0.1 έναντι 6.32±0.15 ng/mL, p<0.001) και IgG ορού (1612±46 έναντι 1377±52 mg/dl, p=0.008) συγκριτικά με αυτούς χωρίς ΒΥΛΕ. Δεν σημειώθηκαν100 σημαντικές διαφορές στα επίπεδα των άλλων φλεγμονωδών δεικτών και των ανοσοσφαιρινών μεταξύ των ασθενών με ασκίτη και ΒΥΛΕ και αυτών χωρίς ΒΥΛΕ. Στους ασθενείς με ασκίτη ΒΥΛΕ, οι τιμές της ηπατικής σκληρίας συσχετίστηκαν σημαντικά με την μέγιστη συγκέντρωση του εκπνεόμενου υδρογόνου(r=0.370;p=0.004), τα επίπεδα LBP ορού (r=0.678;p<0.001) και τις τιμές IgG ορού(r=0.483;p=0.009). Τα επίπεδα LBP ορού συσχετίστηκαν επίσης σημαντικά με τις τιμές της ηπατικής σκληρίας (r=0.315;p=0.01) σε αυτούς ασθενείς. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές συσχετίσεις στους ασθενείς με ασκίτη χωρίς ΒΥΛΕ. Στη διάρκεια της παρακολούθησης (35.7±1.8 μήνες), σημαντικά υψηλότερο ποσοστό ασθενών με ΒΥΛΕ παρουσίασε ρήξη αντιρρόπησης/νέα ρήξη αντιρρόπησης από ότι οι ασθενείς χωρίςΒΥΛΕ: 33/64 (51.5%) έναντι 16/56 (28.5%), p=0.01. Οι ασθενείς με ΒΥΛΕ παρουσίασαν συχνότερα εμφάνιση/υποτροπή ασκίτη (21/64 [32.8%] έναντι 10/56 [17.8%], p=0.06) και ηπατικής εγκεφαλοπάθεια (8/64 [12.5%] έναντι 2/56 [3.5%], p=0.07) συγκριτικάμε αυτούς χωρίς ΒΥΛΕ ενώ τα ποσοστά κιρσορραγίας ήταν παρόμοια στις δύο ομάδες. Το ποσοστό των θανάτων λόγω της κίρρωσης ήταν σημαντικά υψηλότερο στους ασθενείς με ΒΥΛΕ συγκριτικά με αυτούς χωρίς ΒΥΛΕ (19/64 [29.6%] έναντι 8/56[14.2%], p=0.04). Η επιβίωση των ασθενών με ΒΥΛΕ ήταν σημαντικά μικρότερη από ότι οι ασθενείς χωρίς ΒΥΛΕ (56.1% έναντι 80.4% στα 5 έτη, p=0.03). Συμπεράσματα: Οι ασθενείς με κίρρωση λόγω ΑΛΝΗ, ιογενή ηπατίτιδα και ΜΑΛΝΗ, και κυρίως αυτοί με ασκίτη, παρουσιάζουν υψηλό ποσοστό ΒΥΛΕ με την επίπτωση της ΒΥΛΕ να αυξάνεται σημαντικά με την αύξηση της βαρύτητας της κίρρωσης. Η ΒΥΛΕ στους ασθενείς με κίρρωση, και ιδιαίτερα σε αυτούς με ασκίτη, σχετίζεται με υψηλότερα επίπεδα IgG, αυξημένη φλεγμονώδη δραστηριότητα και μεγαλύτερο βαθμό ηπατικής ίνωσης όπως εκτιμάται από την ελαστογραφικά μετρούμενη ηπατική σκληρία. Η ΒΥΛΕ στους ασθενείς με κίρρωση σχετίζεται με περισσότερες επιπλοκές της πυλαίας υπέρτασης και υψηλότερη θνητότητα. Στους ασθενείς με ΧΗΝ χωρίς κίρρωση, η επίπτωση της ΒΥΛΕ, τα επίπεδα ανοσοσφαιρινών του ορού και η ηπατική σκληρία είναι σημαντικά χαμηλότερα σε σχέση με τους ασθενείς με κίρρωση και παρόμοια με τους ασθενείς χωρίς ΧΗΝ.