Μελέτη της παραγωγής βιολογικού πετρελαίου (βιοντήζελ) κατά την καλλιέργεια ελαιογόνων στελεχών ζυμών σε σακχαρούχα ανανεώσιμα υποστρώματα

Abstract

The continuous rise in demand for biofuel production and existing techniques in which mainly edible / conventional oils are used as starting materials for the synthesis of biodiesel (viz. mainly fatty acid methyl-esters deriving from transmethylation of oils / fats), which are unlikely to remain sustainable in the future due to the significant "food vs. fuels" dilemma, highlight the need for biotechnological methods to produce non-conventional lipids that could be converted into biodiesel. Considering the increasing production of waste from various food and fuel industries and the challenges they pose in treatment and disposal, combining biotechnological methods with these inexpensive sources of carbon and other nutrients as starting materials for microbial fermentations to produce high-value-added end products or compounds that could be easily converted into biofuels, can render the entire process economically viable and environmentally friendly. The experiments for this dissertation were conducted in shake flasks and laboratory-scale bioreactors, initially focusing on the growth of various oleaginous yeasts on several types of low-cost hydrophilic compounds employed as microbial substrates. The objective was to use various low-cost sugar-type or glycerol-type components as starting materials for microbial processes to produce microbial lipids (single-cell oils – SCOs), which could serve as precursors for the synthesis of "second-generation" and high-quality biofuels (biodiesel). The most significant results were obtained with the strains Cryptococcus curvatus ATCC 20509 and Lipomyces starkeyi DSM 70296, which were consequently used for most parts of the dissertation. Experiments were conducted with various carbon-to-nitrogen ratios, different initial concentrations of the saccharide (or glycerol-based) carbon source, and variations in the nature of the carbon source to maximize microbial lipid production. Commercial lactose derived from cheese-whey was mainly used as a carbon source in the first case, due to the ability of the microorganism C. curvatus to utilize this carbon source. The effects of inorganic and organic nitrogen sources on growth and lipid production were also examined. This microorganism was also cultured in commercial xylose, a relatively low-cost sugar widely used in the chemical synthesis of xylitol, as a carbon source. On the other hand, L. starkeyi did not show high growth in lactose but exhibited very satisfactory growth in commercial xylose. Subsequently, experiments were conducted using industrial glycerol as the carbon source for both strains. Industrial glycerol is the main by-product generated during biodiesel production process, and the quantities of this by-product are very large and continuously increasing. Olive mill wastewater (OMW) was used as a co-substrate for the processes (simultaneous use of this wastewater as a carbon source and water employed in the fermentation, in order to partially replace tap water normally used in these processes). Simultaneously, experiments were conducted to evaluate various lipid extraction methods, and fermentations were carried out in bioreactors using wastes or low-cost products such as whey (concentrated or not), commercial xylose, glycerol, and OMWs, added into the liquid media in order to yield at different initial concentrations of phenolic compounds. OMW and low-cost xylose (derived from lignocellulosic materials) were simultaneously used as substrates for microbial growth to form nutrient media with similar initial xylose concentrations (≈70 and ≈100 g/L) but different initial concentrations of phenolic compounds (0,0 – control experiment, 1,0, 1,5, and 2,0 g/L) to assess the ability of Cryptococcus curvatus ATCC 20509 and Lipomyces starkeyi DSM 70296 to produce lipids, intracellular polysaccharides (IPS), and xylitol under nitrogen-limited conditions while also potentially detoxifying (i.e. removing color and phenolic compounds) the waste. Results showed that for L. starkeyi, increasing the concentration of phenolic compounds did not significantly affect biomass production and even slightly increased it, while lipids showed an increase compared to the control experiment. For the control, the maximum biomass and lipid values for L. starkeyi were 24,8 and 11,8 g/L, respectively (within ~200 hours), whereas in the experiment with 2,0 g/L phenolic compounds, biomass and lipids reached 20,5 and 9,6 g/L. However, IPS production was negatively affected, decreasing from 20% w/w in the control to 5% w/w. Additionally, a reduction of phenolic compounds (~30% w/w) was observed, which was not accompanied by a corresponding decolorization of the waste. Notably, xylitol production reached 5,1 g/L. In a fed-batch culture systems using a laboratory-scale bioreactor, L. starkeyi produced 60,2 g/L biomass containing 54,3% lipids (lipids = 32,7 g/L, productivity ≈ 0,32 g/L/h) within 108 hours. C. curvatus was cultured in mixtures of xylose and OMW with increasing initial phenolic compound levels (from 0.0 g/L – control experiment without addition of OMW to 2,0 g/L). While biomass levels were unaffected, lipid content decreased. In a batch bioreactor experiment performed without OMW addition, C. curvatus produced 37,0 g/L of total biomass, containing approximately 45% w/w lipids using xylose as the starting material. C. curvatus ATCC 20509 also demonstrated the ability to grow in high initial lactose concentrations (up to 200 g/L), although the optimal concentration appears to be 100–120 g/L, which is promising for treating wastes with high lactose content (i.e. concentrated deproteinized cheese-whey). In experiments conducted with culture media containing commercial lactose derived from cheese-whey, where OMW was partially used as fermentation liquid in order to partially replace the employed tap water, the microorganism's ability to grow and produce SCOs was studied under constant initial sugar concentration (~40 g/L) and varying initial phenolic compound concentrations (0,0 – control, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, and 2,5 g/L). Results indicated that as phenolic concentration increased, biomass and lipid production decreased compared to the control, where 12,0 g/L biomass and 3,8 g/L lipids were obtained. At an initial phenolic concentration of 2,5 g/L, the corresponding values were 5,5 g/L and 1,5 g/L. At lower initial phenolic concentrations, biomass and lipid production were less affected, and a reduction in phenolic concentration and decolorization (up to 36% and 27%, respectively, at 1,0 g/L phenolics) were observed. Under identical fermentation conditions, various lipid extraction methods were compared for L. starkeyi DSM 70296. The Folch method (i.e. utilization of a mixture of chloroform / methanol at 2/1 v/v in which dry biomass remained for some days in darkness), acid cell lysis (HCl), and a combination of both were tested. Under said fermentation conditions (biomass for all methods was 24 ± 1,8 g/L) lipid yields were respectively 2,4 g/L (utilization of Folch solvent for three days), 5,6 g/L (Folch for five days), 9,1 g/L (acid lysis), and 10,2 g/L (combination of acid lysis followed by Folch). The respective yields for Soxhlet extraction, ultrasonics followed by Folch and green solvents were 15,8, 6,4, and 5,1 g/L respectively. Corresponding lipid yields (lipids as % of dry biomass, YL/X % w/w) were 9,8, 22,1, 35,8, 40,6, 63,5, 25,6, and 21,0%. Finally, fed-batch bioreactor experiments were conducted using Cryptococcus curvatus ATCC 20509 and Lipomyces starkeyi DSM 70296 in media with OMWs enriched with crude glycerol used as carbon source, providing an initial glycerol concentration of 45 g/L. For C. curvatus, biomass reached 36,0 g/L, and lipids were 16,6 g/L with a lipid yield of 43,3% w/w. For L. starkeyi, biomass was slightly lower (34,8 g/L), but lipids (19,6 g/L) and lipid yield (56,3%) were higher. The fatty acid composition of the cellular produced lipids presented for all species studied a predominance of oleic acid ~53%. Moreover, palmitic acid was found ~25%, rendering the yeast lipid suitable for its subsequent conversion into 2nd generation biodiesel. Concluding, non-conventional yeast strains, mostly belonging to the species C. curvatus and L. starkeyi were revealed as capable candidates for the conversion of abundant low-cost agro-industrial resources (i.e. whey, lactose, xylose, glycerol diluted, in various ratios, into OMWs) into SCOs with satisfactory lipid productions and productivities. Cell densities recorded in several growth conditions and mainly in fed-batch laboratory-scale bioreactor trials were very high, and comparable with some of the best values of the international literature. The fatty acid composition of yeast lipids produced presented similarities with that of commodity vegetable oils, constituting perfect candidates for their conversion into 2nd generation biodiesel. Therefore, the yeast strains tested in this study could be regarded as possible candidates for simultaneous treatment / valorization of abundant low-cost hydrophilic compounds, and their satisfactory bioconversion into SCOs, amenable to constitute the precursors of high-quality biodiesel.

Η συνεχής αύξηση στη ζήτηση για παραγωγή βιοκαυσίμων και οι υπάρχουσες τεχνικές που φαίνεται ότι δεν θα δύνανται να είναι βιώσιμες μελλοντικά λόγω του σοβαρού διλήμματος «food vs fuels», δείχνουν την ανάγκη για την εξεύρεση βιοτεχνολογικών μεθόδων παραγωγής των προϊόντων αυτών. Έχοντας υπόψιν την αυξανόμενη παραγωγή αποβλήτων από τις διάφορες βιομηχανίες τροφίμων και καυσίμων και τη δυσκολία που παρουσιάζουν στην εξυγίανση και απόρριψή τους, ο συνδυασμός βιοτεχνολογικών μεθόδων με τις φτηνές αυτές πηγές άνθρακα και άλλων θρεπτικών στοιχείων χρησιμοποιουμένων ως υλικών εκκίνησης των μικροβιακών ζυμώσεων για τη παραγωγή τελικών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας ή και βιοκαυσίμων, δύναται να καταστήσει την όλη διαδικασία οικονομικά συμφέρουσα και φιλική προς το περιβάλλον. Στην ανωτέρω προσέγγιση / φιλοσοφία κινείται και η παρούσα διδακτορική διατριβή, στόχος της οποίας είναι η δυνατότητα αξιοποίησης ποικίλων υδρόφιλων χαμηλού κόστους υλικών (π.χ. εμπορική λακτόζη, εμπορική ξυλόζη, τυρόγαλα, ακάθαρτη γλυκερόλη και υγρά απόβλητα ελαιοτριβείων) προς παραγωγή κυτταρικής μάζας που θα περιέχει σε αξιοσημείωτα ποσά μικροβιακά λιπίδια. Το σύνολο των πειραμάτων της διατριβής διεξήχθησαν σε κωνικές φιάλες και σε εργαστηριακής κλίμακας βιοαντιδραστήρες εξετάζοντας αρχικά την αύξηση διαφόρων ελαιογόνων ζυμών. Ο στόχος της μελέτης ήταν η χρήση διαφόρων χαμηλού κόστους υδροφίλων συστατικών ως υλικών εκκίνησης των μικροβιακών διεργασιών προκειμένου να παραχθούν μικροβιακά λιπίδια (single cell oils – SCOs) τα οποία θα μπορούσαν να αποτελέσουν τον προάγγελο της σύνθεσης «2ης γενιάς» και υψηλής ποιότητας βιολογικού πετρελαίου (βιοντήζελ). Τα πιο ενδιαφέροντα αποτελέσματα εξήχθησαν με τα στελέχη Cryptococcus curvatus ATCC 20509 και Lipomyces starkeyi DSM 70296, ως εκ τούτου αυτά χρησιμοποιήθηκαν στο μεγαλύτερο μέρος της διατριβής. Πειράματα έλαβαν χώρα σε διάφορους λόγους άνθρακα/αζώτου, με ποικίλες αρχικές συγκεντρώσεις της σακχαρούχου (ή γλυκερινούχου) πηγής άνθρακα καθώς και με τη φύση της πηγής αζώτου με σκοπό την μέγιστη παραγωγή μικροβιακών λιπιδίων. Σαν πηγή άνθρακα στη πρώτη περίπτωση έχει χρησιμοποιηθεί κυρίως λακτόζη που προέρχεται από τυρόγαλα, λόγω της ικανότητας του μικροοργανισμού C. curvatus να την αναλώνει, ενώ εξετάζεται και η επίδραση του ανόργανου και του οργανικού αζώτου στην ανάπτυξη και παραγωγή λιπιδίων. Ο μικροοργανισμός αυτός καλλιεργήθηκε επίσης και στην εμπορική ξυλόζη, ένα σχετικά χαμηλής αξίας σάκχαρο το οποίο ευρέως χρησιμοποιείται στη χημική σύνθεση της ξυλιτόλης, χρησιμοποιούμενη ως πηγή άνθρακα. Από την άλλη πλευρά, ο μικροοργανισμός L. starkeyi δεν έδωσε αύξηση στη λακτόζη, ενώ έδωσε πολύ ικανοποιητική αύξηση στην εμπορική ξυλόζη. Στη συνέχεια εκτελέστηκαν πειράματα και με πηγή άνθρακα τη βιομηχανική γλυκερόλη και στα δύο στελέχη. Η βιομηχανική γλυκερόλη είναι το κύριο παράπλευρο συστατικό το οποίο δημιουργείται κατόπιν της σύνθεσης βιοντήζελ, οι δε ποσότητες αυτού του παραπροϊόντος είναι πολύ μεγάλες και διαρκώς αυξανόμενες. Τα υγρά απόβλητα ελαιουργείων (ΥΑΕ) χρησιμοποιήθηκαν ως συν-υπόστρωμα των διεργασιών (παράλληλη χρήση των αποβλήτων αυτών ως πηγής άνθρακα και ως υγρού της ζύμωσης). Ταυτόχρονα διενεργήθηκαν πειράματα στα οποία εξετάζονται διάφορες μέθοδοι παραλαβής λιπιδίων, ενώ πραγματοποιήθηκαν και ζυμώσεις σε βιοαντιδραστήρα παρουσία αποβλήτων ή χαμηλού κόστους προϊόντων όπως τυρόγαλα (συμπυκνωμένο ή μη), εμπορική ξυλόζη, γλυκερόλη και ΥΑΕ (προστιθέμενα σε διάφορες αναλογίες ώστε να υπάρχουν στο μέσο αύξησης ποικίλες αρχικές συγκεντρώσεις φαινολικών συστατικών). Τα ΥΑΕ και η ξυλόζη που προέρχεται από λιγνοκυτταρινούχες ύλες, χρησιμοποιούνται συγχρόνως ως υποστρώματα για την αύξηση μικροοργανισμών. Σκοπός είναι να δημιουργηθούν θρεπτικά μέσα που παρουσιάζουν παρόμοια αρχική συγκέντρωση ξυλόζης (≈70 και ≈100 g/L) και διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις φαινολικών ενώσεων (0,0 - τυφλό, 1,0, 1,5 και 2,0 g/L), προκειμένου να εξεταστεί η δυνατότητα των ζυμών Cryptococcus curvatus ATCC 20509 και Lipomyces starkeyi DSM 70296 να παράγουν λιπίδια, ενδοπολυσακχαρίτες (IPS) και ξυλιτόλη σε περιοριστικές σε άζωτο συνθήκες και ταυτόχρονα να επιτελεστεί σχετική αποτοξίνωση του αποβλήτου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι για το μικροοργανισμό L. starkeyi με την αύξηση της συγκέντρωσης των φαινολικών ενώσεων η παραγωγή βιομάζας δεν επηρεάστηκε σημαντικά και μάλιστα αυξήθηκε ελαφρώς, ενώ τα λιπίδια παρουσίασαν αύξηση σε σχέση με το πείραμα χωρίς την παρουσία φαινολικών ενώσεων. Στο τυφλό η μέγιστη βιομάζα και λίπος για το L. starkeyi ήταν 24,8 και 11,8 g/L αντίστοιχα (μέσα σε ~200 h), ενώ στο πείραμα με 2,0 g/L φαινολικών, η βιομάζα και το λίπος ήταν 20,5 και 9,6 g/L. Ωστόσο η παραγωγή IPS φάνηκε να επηρεάζεται αρνητικά, καθώς από 20% w/w στο τυφλό, μειώθηκαν στο 5% w/w επί ξ.ο.. Παρατηρήθηκε επίσης μια μείωση της συγκέντρωσης των φαινολικών ενώσεων (~40% w/w), η οποία δεν συνοδεύτηκε από αντίστοιχο αποχρωματισμό του αποβλήτου. Αξίζει να σημειωθεί πως παρατηρήθηκε παραγωγή ξυλιτόλης σε ποσότητα 5,1 g/L. Σε ημι-συνεχές τροφοδοτούμενο σύστημα καλλιέργειας σε εργαστηριακής κλίμακας βιοπαντιδραστήρα, ο μικροοργανισμός Lipomyces starkeyi παρήγαγε εντός 108 ωρών 60,2 g/L βιομάζας που περιείχε 54,3% λίπος επί ξ.ο. (λίπος = 32,7 g/L, παραγωγικότητα ≈ 0,32 g/L/h). Ο μικροοργανισμός C. curvatus καλλιεργήθηκε σε μίγματα ξυλόζης και ΥΑΕ και με αυξανόμενες αρχικές τιμές φαινολικών συστατικών (μελέτες από 0.0 g/L – μάρτυρας χωρίς ΥΑΕ έως 2,0 g/L), ενώ οι τιμές βιομάζας δεν μειώνονταν, μειωνόταν το ποσοστό λίπους επί ξηράς ουσίας. Σε κλειστό βιοαντιδραστήρα χωρίς προσθήκη ΥΑΕ, ο μικροοργανισμός C. curvatus με την ξυλόζη ως υλικό εκκίνησης παρήγαγε 37,0 g/L συνολικής βιομάζας η οποία περιείχε περίπου 45% w/w λιπίδια. Στην περίπτωση του μικροοργανισμού Cryptococcus curvatus ATCC 20509 ο εν λόγω μικροοργανισμός έδειξε ικανότητα να αυξάνεται και σε υψηλές αρχικές συγκεντρώσεις λακτόζης (έως και 200 g/L) αν και η βέλτιστη συγκέντρωση λακτόζης φαίνεται να βρίσκεται στα 100 - 120 g/L, γεγονός όμως που είναι ενθαρρυντικό όσον αφορά στην επεξεργασία αποβλήτων με υψηλές συγκεντρώσεις του ανωτέρω σακχάρου. Σε πειράματα που διεξήχθησαν σε θρεπτικό μέσο που περιείχε εμπορική λακτόζη που προερχόταν από τυρόγαλα, όπου τα ΥΑΕ χρησιμοποιήθηκαν εν μέρει ως υγρό ζύμωσης, μελετήθηκε η ικανότητα του μικροοργανισμού να αναπτύσσεται και να παράγει λίπος, υπό συνθήκες σταθερής αρχικής συγκέντρωσης σακχάρου (~40 g/L) και διαφορετικής αρχικής συγκέντρωσης φαινολικών συστατικών (αρχική συγκέντρωση φαινολικών 0,0 - μάρτυρας, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 και 2,5 g/L). Παρατηρήθηκε πως όσο αυξάνει η συγκέντρωση των φαινολικών, η βιομάζα και η παραγωγή λίπους μειώνεται σε σχέση με το μάρτυρα, όπου είχαμε 12,0 g/L βιομάζα και 3,8 g/L λιπίδια, ενώ σε αρχική συγκέντρωση φαινολικών 2,5 g/L οι αντίστοιχες τιμές ήταν 5,5 g/L και 1,5 g/L. Στις μικρότερες όμως αρχικές συγκεντρώσεις φαινολικών συστατικών η βιομάζα και η παραγωγή λίπους επηρεάστηκε λιγότερο, ενώ παρατηρήθηκε και μια μείωση στη συγκέντρωση των φαινολικών, καθώς και αποχρωματισμός μέχρι και της τάξεως του 28% και 30% αντίστοιχα (στην περίπτωση όπου είχαμε αρχική συγκέντρωση φαινολικών 1,0 g/L). Σε ζυμώσεις υπό παρόμοιες συνθήκες έγινε σύγκριση των ακολούθων διαδικασιών για τη παραλαβή του λίπους στο μικροοργανισμό Lipomyces starkeyi DSM 70296: η μέθοδος Folch σε δείγματα που παρέμειναν σε μίγμα χλωροφορμίου/μεθανόλης (Folch) 2/1 (v/v) υπό σκιά για τρεις και πέντε ημέρες αντίστοιχα, η μέθοδος όξινης λύσης των κυττάρων (HCl) για παραλαβή του λίπους και τέλος ο συνδυασμός των δύο προαναφερθεισών μεθόδων. Έχοντας εξασφαλίσει τις ίδιες συνθήκες ζύμωσης για όλα τα δείγματα, και κατά συνέπεια η βιομάζα για όλες τις μεθόδους είναι 24 ± 1,8 g/L, παρατηρήθηκε πως όταν το δείγμα αφέθηκε στο αντιδραστήριο Folch για τρεις ημέρες παραλάβαμε 2,4 g/L λιπιδίων και στις πέντε ημέρες 5,6 g/L. Στην όξινη μέθοδο είχαμε 9,1 g/L και στο συνδυασμό των δύο μεθόδων 10,2 g/L. Στην εκχύλιση με τη χρήση συσκευής Soxhlet, τη χρήση υπερήχων και διαλύτη εκχύλισης το αντιδραστήριο Folch και τους πράσινους διαλύτες οι αντίστοιχες τιμές ήταν 15,8, 6,4 και 5,1 g/L. Οι αντίστοιχες αποδόσεις (λίπος επί ξηράς ουσίας, YL/X % w/w) ήταν 9,8, 22,1, 35,8, 40,6, 63,5, 25,6και 21,0%. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν πειράματα σε βιοαντιδραστήρα ημι-συνεχούς τροφοδοτούμενης διεργασίας χρησιμοποιώντας τους μικροοργανισμούς Cryptococcus curvatus ATCC 20509 και Lipomyces starkeyi DSM 70296. Ως υγρό ζύμωσης χρησιμοποιήθηκαν τα ΥΑΕ εμπλουτισμένα με ακάθαρτη γλυκερόλη ως πηγή άνθρακα, ώστε να έχει μια αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης 45 g/L. Παρατηρήθηκε πως στη περίπτωση του C. curvatus η βιομάζα έφτασε τα 36,0 g/L και το λίπος αντίστοιχα 16,6 g/L με μια απόδοση λίπους επί ξ.ο. 43,3% w/w. Κατά αντιστοιχία στο L starkeyi ενώ η βιομάζα ήταν ελαφρώς χαμηλότερη (34,8 g/L), τα λιπίδια κατά απόλυτη τιμή και ως απόδοση ήταν αυξημένα, ήτοι 19,6 g/L και 56,3%. Η σύσταση των λιπιδίων σε λιπαρά οξέα που παράγονται από τα κύτταρα παρουσίαζε κυρίως κυριαρχία του ελαϊκού οξέος ~53% κατά μέσο όρο, για όλα τα είδη που μελετήθηκαν. Επιπλέον, ανιχνεύθηκε παλμιτικό οξύ ~25% κατά μέσο όρο, καθιστώντας τα λιπίδια της ζύμης κατάλληλα για τη μετέπειτα μετατροπή τους σε βιοντήζελ 2ης γενιάς. Συμπερασματικώς, μη συμβατικά στελέχη ζυμών, κυρίως ανήκοντα στα είδη C. curvatus και L. starkeyi, αναδείχθηκαν ως ικανοί υποψήφιοι για τη μετατροπή άφθονων και χαμηλού κόστους αγροτοβιομηχανικών πόρων (π.χ. τυρόγαλα, λακτόζη, ξυλόζη, αραιωμένη γλυκερόλη σε διάφορες αναλογίες, μέσα σε υγρά απόβλητα ελαιουργείων - OMWs) σε έλαια από μονοκύτταρους μικροοργανισμούς (SCOs), με ικανοποιητικές παραγωγές και αποδοτικότητες λιπιδίων. Οι πυκνότητες κυττάρων που καταγράφηκαν σε διάφορες συνθήκες αύξησης, και κυρίως σε πειράματα ημι-συνεχούς καλλιέργειας σε εργαστηριακής κλίμακας βιοαντιδραστήρες, ήταν πολύ υψηλές και συγκρίσιμες με μερικές από τις καλύτερες τιμές της διεθνούς βιβλιογραφίας. Η σύνθεση λιπαρών οξέων των λιπιδίων που παράχθηκαν από τις ζύμες παρουσίασε ομοιότητες με αυτή των φυτικών ελαίων ευρείας χρήσης, καθιστώντας τα ιδανικούς υποψήφιους για μετατροπή σε βιοντήζελ δεύτερης γενιάς. Επομένως, τα στελέχη ζυμών που δοκιμάστηκαν σε αυτή τη μελέτη μπορούν να θεωρηθούν ως πιθανοί υποψήφιοι για ταυτόχρονη επεξεργασία/αξιοποίηση άφθονων, χαμηλού κόστους υδρόφιλων ενώσεων και την ικανοποιητική βιομετατροπή τους σε μικροβιακά λιπίδια που μπορούν να αποτελέσουν πρόδρομες ύλες για βιοντήζελ υψηλής ποιότητας.