Ανάπτυξη πρότυπης μεθόδου απομόνωσης κοκκωδών κυττάρων από ωοθυλακικό υγρό με χρήση μαγνητικών νανοϋλικών, μετά από διέγερση των ωοθυλακίων

Abstract

This doctoral dissertation focuses on the development of an innovative method for isolating granulosa cells (GCs) from follicular fluid using magnetic nanomaterials following follicular stimulation. Granulosa cells play a crucial role in reproductive biology, contributing to oocyte maturation, hormonal regulation of the reproductive cycle, and overall gamete quality. The ability to effectively isolate these cells is of paramount importance both for understanding reproductive mechanisms and for their clinical applications in assisted reproductive technologies.The research is based on the use of magnetic nanomaterials for the selective isolation of granulosa cells. These nanomaterials were synthesized and modified to achieve high selectivity and efficient cell capture. Specifically, iron oxide (Fe₃O₄) nanoparticles were coated with silicon dioxide (SiO₂) and further functionalized with hyaluronic acid (HA). Hyaluronic acid was chosen as a biocompatible and highly specific adhesion surface for granulosa cells due to the presence of HA receptors on their surface. To evaluate the method, physicochemical characterization of the nanomaterials was performed using techniques such as Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) and dynamic light scattering (DLS) to determine the size and surface charge of the nanoparticles. Additionally, selective binding of granulosa cells was assessed through flow cytometry and microscopic imaging, confirming the efficiency of the approach. In the experimental section, the new method was compared with conventional isolation techniques, such as density gradient centrifugation (Percoll/Ficoll) and fluorescence-activated cell sorting (FACS). The novel approach demonstrated significant advantages, yielding higher purity of the isolated cells while maintaining high levels of viability and metabolic activity. The cytotoxicity of the nanomaterials was evaluated using MTT viability assays, confirming their biocompatibility. The study was validated through repeated experiments, and the analysis of the results highlighted the statistically significant superiority of the new method over conventional approaches. Comparative evaluation confirmed that the use of magnetic nanomaterials provides an innovative, efficient, and non-destructive approach for granulosa cell isolation while preserving their integrity and functionality. In conclusion, this dissertation presents a novel methodological approach to cell isolation that can improve gamete quality assessment techniques and be integrated into clinical protocols in assisted reproductive technologies. The development of this technology opens new prospects for the application of magnetic nanomaterials in reproductive biology, offering faster and more efficient solutions for cell isolation, with potential applications in other reproductive cell types.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στην ανάπτυξη μιας πρωτότυπης μεθόδου απομόνωσης κοκκωδών κυττάρων (GCs) από το ωοθυλακικό υγρό, χρησιμοποιώντας μαγνητικά νανοϋλικά, μετά από διέγερση των ωοθυλακίων. Η σημασία των κοκκωδών κυττάρων στην αναπαραγωγική βιολογία είναι θεμελιώδης, καθώς διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στην ωρίμανση των ωαρίων, στην ορμονική ρύθμιση του αναπαραγωγικού κύκλου και στη συνολική ποιότητα των γαμετών. Η δυνατότητα αποτελεσματικής απομόνωσής τους είναι ζωτικής σημασίας τόσο για την κατανόηση των μηχανισμών της αναπαραγωγής όσο και για την κλινική αξιοποίηση των κυττάρων αυτών σε εφαρμογές υποβοηθούμενης αναπαραγωγής. Το ερευνητικό έργο βασίζεται στη χρήση μαγνητικών νανοϋλικών για την εκλεκτική απομόνωση των κοκκωδών κυττάρων. Τα νανοϋλικά αυτά συντέθηκαν και τροποποιήθηκαν κατάλληλα ώστε να επιτυγχάνουν υψηλή εκλεκτικότητα και αποδοτικότητα δέσμευσης των στόχων κυττάρων. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν νανοσωματίδια οξειδίου του σιδήρου (Fe₃O₄), τα οποία επικαλύφθηκαν με διοξείδιο του πυριτίου (SiO₂) και στη συνέχεια λειτουργικοποιήθηκαν με υαλουρονικό οξύ (HA). Το υαλουρονικό οξύ επιλέχθηκε ως βιοσυμβατή και ειδική για τα κοκκώδη κύτταρα επιφάνεια προσκόλλησης, καθώς τα κύτταρα αυτά φέρουν υποδοχείς για τη συγκεκριμένη βιοπολυμερή ένωση. Για την αξιολόγηση της μεθόδου, πραγματοποιήθηκαν πειράματα φυσικοχημικού χαρακτηρισμού των νανοϋλικών με τη χρήση τεχνικών όπως η φασματοσκοπία υπερύθρου μετασχηματισμού Fourier (FTIR) και η δυναμική σκέδαση φωτός (DLS) για τον καθορισμό του μεγέθους και της επιφανειακής φορτισής των νανοσωματιδίων. Παράλληλα, εξετάστηκε η εκλεκτική δέσμευση των κοκκωδών κυττάρων μέσω κυτταρομετρίας ροής και μικροσκοπικών απεικονίσεων, επιβεβαιώνοντας την επιτυχία της προσέγγισης. Στο πειραματικό μέρος, πραγματοποιήθηκε σύγκριση της νέας μεθόδου με κλασικές τεχνικές απομόνωσης, όπως η φυγοκέντρηση διαβάθμισης πυκνότητας (Percoll/Ficoll) και η κυτταρομετρία ροής (FACS). Η νέα τεχνική εμφάνισε συγκριτικά πλεονεκτήματα, καθώς οδήγησε σε αυξημένη καθαρότητα των απομονωμένων κυττάρων, διατηρώντας υψηλά επίπεδα βιωσιμότητας και μεταβολικής δραστηριότητας. Η τοξικότητα των νανοϋλικών αξιολογήθηκε μέσω δοκιμών κυτταρικής βιωσιμότητας (MTT assay), αποδεικνύοντας την ασφάλεια της χρήσης τους. Η μελέτη επικυρώθηκε μέσω επαναλαμβανόμενων πειραμάτων, ενώ η ανάλυση των αποτελεσμάτων ανέδειξε τη στατιστικά σημαντική υπεροχή της νέας μεθόδου έναντι των συμβατικών προσεγγίσεων. Η συγκριτική αξιολόγηση επιβεβαίωσε ότι η χρήση μαγνητικών νανοϋλικών προσφέρει μια καινοτόμο, αποδοτική και μη καταστρεπτική προσέγγιση για την απομόνωση κοκκωδών κυττάρων, διατηρώντας την ακεραιότητα και τη λειτουργικότητα των κυττάρων. Συμπερασματικά, η διατριβή αυτή προσφέρει μια νέα μεθοδολογική προσέγγιση στην κυτταρική απομόνωση, η οποία μπορεί να βελτιώσει τις τεχνικές αξιολόγησης της ποιότητας των γαμετών και να βρει εφαρμογή σε κλινικά πρωτόκολλα υποβοηθούμενης αναπαραγωγής. Η ανάπτυξη αυτής της τεχνολογίας ανοίγει νέες προοπτικές στη χρήση μαγνητικών νανοϋλικών στην αναπαραγωγική βιολογία, προσφέροντας ταχύτερες και αποτελεσματικότερες λύσεις στην κυτταρική απομόνωση, με δυνατότητες εφαρμογής και σε άλλους τύπους κυττάρων του αναπαραγωγικού συστήματος.