Βone quality assessment in normal and diseased tissues using vibrational spectroscopy, neutron diffraction and multivariate analysis

Abstract

Osteoporosis, a metabolic bone disorder characterized by reduced bone mass and compromised microarchitecture, presents a significant challenge due to its association with increased fracture risk. This thesis investigates the molecular and structural changes in bone associated with osteoporosis using a multidisciplinary approach, combining Raman spectroscopy, neutron powder diffraction, and an inflammation-mediated osteoporosis (IMO) model. These methods collectively provide insights into the compositional, and crystallographic properties of bone, enabling a comprehensive evaluation of bone quality. Bone samples, including healthy and osteoporotic specimens generated using the IMO model, were analyzed across multiple skeletal sites—tibia, humerus, femur, and rib. Raman spectroscopy was employed to explore bone quality-specific spectral regions, such as phosphate, carbonate, amide I, and collagen-related bands, using advanced preprocessing techniques and computational tools. Custom software developed for this thesis facilitated multivariate analyses, including Principal Component Analysis (PCA), Partial Least Squares Discriminant Analysis (PLS-DA), as well as band deconvolution. Quantitative bone quality parameters, including mineral crystallinity, mineral-to-matrix ratio, collagen maturity, and carbonate substitution, were calculated to reveal site-specific and systemic changes. Neutron powder diffraction complemented these findings by providing detailed information on the crystallographic structure of bone mineral. This technique offered valuable insights into the atomic arrangement and phase composition of hydroxyapatite, enhancing the understanding of structural alterations associated with osteoporosis. The results reveal significant trends and variations in molecular composition and crystallographic properties across skeletal sites, underscoring the impact of inflammation-induced osteoporosis. By combining Raman spectroscopy, neutron diffraction, and the IMO model, this work establishes a robust analytical framework for studying skeletal health. Furthermore, the custom software developed as part of this research advances the precision and reproducibility of Raman spectral analysis and provides another tool for spectroscopic analyses to the scientific community.

Η οστεοπόρωση, μια μεταβολική διαταραχή των οστών που χαρακτηρίζεται από ελαττωμένη οστική μάζα και εξασθενημένη μικροαρχιτεκονική, αποτελεί σημαντική πρόκληση λόγω της συσχέτισής της με αυξημένο κίνδυνο καταγμάτων. Η παρούσα διατριβή ερευνά τις μοριακές και δομικές αλλαγές που σχετίζονται με την οστεοπόρωση χρησιμοποιώντας μια διεπιστημονική προσέγγιση, συνδυάζοντας τη φασματοσκοπία Raman, την περίθλαση νετρονίων σε σκόνη, και ένα μοντέλο οστεοπόρωσης που προκαλείται από φλεγμονή. Συνολικά οι μέθοδοι αυτές παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τη σύνθεση και τις κρυσταλλογραφικές ιδιότητες του οστού, επιτρέποντας μια ολοκληρωμένη αξιολόγηση της οστικής ποιότητας. Αναλύθηκαν δείγματα οστών που ελήφθησαν από διαφορετικές περιοχές (κνήμη, βραχίονα, μηρό, και πλευρό) υγιών ζώων και ζώων στα οποία προκλήθηκε οστεοπόρωση μέσω φλεγμονής. Η φασματοσκοπία Raman χρησιμοποιήθηκε για τη διερεύνηση φασματικών περιοχών που σχετίζονται με την οστική ποιότητα, όπως οι περιοχές των φωσφορικών και ανθρακικών ιόντων, του αμιδίου Ι, και περιοχές που σχετίζονται με το κολλαγόνο, χρησιμοποιώντας προηγμένες τεχνικές προεπεξεργασίας και υπολογιστικά εργαλεία. Εξειδικευμένο λογισμικό που αναπτύχθηκε για την παρούσα διατριβή διευκόλυνε την εφαρμογή μεθόδων πολυπαραμετρικής ανάλυσης, συμπεριλαμβανομένων της ανάλυσης κυρίων συνιστωσών (Principal Component Analysis; PCA), της ανάλυσης διάκρισης μερικών ελαχίστων τετραγώνων (Partial Least Squares Discriminant Analysis; PLS-DA), καθώς και την αποσυνέλιξη κορυφών. Πραγματοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισμός των παραμέτρων της οστικής ποιότητας, συμπεριλαμβανομένων της κρυσταλλικότητας του υδροξυαπατίτη, του λόγου του ανόργανου μέρους του οστού προς το οργανικό, η ωριμότητα του κολλαγόνου, και η ανθρακική υποκατάσταση, με σκοπό τον προσδιορισμό συστημικών αλλαγών και αλλαγών που οφείλονται στη θέση του οστού. Η περίθλαση νετρονίων σε σκόνη παρείχε λεπτομερείς πληροφορίες για την κρυσταλλογραφική δομή του ανόργανου τμήματος του οστού. Η τεχνική αυτή προσέφερε πολύτιμες πληροφορίες για την ατομική διάταξη και τη σύνθεση των φάσεων του υδροξυαπατίτη, ενισχύοντας την κατανόηση των δομικών μεταβολών που σχετίζονται με την οστεοπόρωση. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν σημαντικές διαφοροποιήσεις στη μοριακή σύνθεση και τις κρυσταλλογραφικές ιδιότητες σε όλες τις σκελετικές περιοχές, υπογραμμίζοντας τον αντίκτυπο της οστεοπόρωσης που προκαλείται από φλεγμονή. Με τον συνδυασμό της φασματοσκοπίας Raman, της περίθλασης νετρονίων και του μοντέλου προκλητής οστεοπόρωσης μέσω φλεγμονής, η εργασία αυτή δημιουργεί ένα αναλυτικό πλαίσιο για τη μελέτη της υγείας του σκελετού. Επιπλέον, το εξειδικευμένο λογισμικό που αναπτύχθηκε στο πλαίσιο αυτής της έρευνας συμβάλλει στην ακρίβεια και την αναπαραγωγιμότητα αναλύσεων φασματοσκοπίας Raman και παρέχει ένα ακόμη εργαλείο για φασματοσκοπικές αναλύσεις στην επιστημονική κοινότητα.