Essential oil loaded collagen hydrogels to battle bacterial infections for tissue engineering applications

Abstract

Increased consumption and misuse of antimicrobial agents in both humans and animals have contributed to the spread of antimicrobial resistance, which seriously threatens public and animal health. Whereas infections due to antimicrobial resistance exhibited by bacteria can be adaptive, intrinsic, and acquired, multidrug-resistant bacteria (e.g., methicillin-resistant Staphylococcus aureus) cause infections that end up with longer hospitalization periods, remarkable morbidity, and mortality, as well as high healthcare costs. According to Organization of Economic Cooperation and Development (OECD) report, approximately 2.4 million people are expected to die due to this kind of infection in North America, Australia, and Europe over the next three decades, and treatment cost may reach USD 3.5 billion per year. In general, S. aureus is one of the major opportunistic human pathogens, which can escape the immune system. Among the wide variety of infections, S. aureus is a well-known bacterium associated with wound infections, where the outermost layer of wounds is colonized. In particular, S. aureus-caused infections may be evaluated as a potential risk factor for methicillin-resistant S. aureus (MRSA) concern, which has brought about the need for development of alternative antimicrobials to substitute traditional antibiotics. Moreover, S. aureus (especially MRSA) has the ability to adhere to living or inert surfaces, secreting an extracellular polymeric substance of proteins, polysaccharides, nucleic acids, and water, known as a biofilm. Subsequently, the biofilm matrix acts as a physical barrier that prevents the permeability of the drug into the bacterial community and helps the microbe resist and minimize the effect of traditional antibiotics. These challenges have given rise to a significant interest in the scientific community in developing herbal-based therapeutics with antimicrobial activity (e.g., essential oils) as a safer and green alternative to antibiotics. Essential oils (EOs) are colored, aroma-rich, complex hydrophobic liquids, also known as volatile oils. They are defined as the secondary metabolic product of aromatic plants and are found in various plant parts such as flowers, roots, barks, stems, leaves, and seeds. EOs are potential agents to diminish antimicrobial resistance due to their significant therapeutic properties (i.e., antibacterial, antiseptic, and antioxidant activities). For this reason, EOs from pharmaceutical plants have also been examined as potent antimicrobial agents in animal production systems. The antimicrobial activity of EOs does not only stem from their qualitative chemical composition, but also from the quantitative intensity of every single component that is included in the structure, as well as all plant-based products. Their complex composition mainly includes terpenes (generally monoterpenes and sesquiterpenes) and terpenoids. Even though some of these chemicals are water soluble, most of them are hydrophobic, so EOs are defined as hydrophobic. In this study, EOs of Thymus sibthorpii, Origanum vulgare, Salvia fruticosa, and Crithmum maritimum plants were chosen as the potential antimicrobial agents against various S. aureus strains to deal with the antimicrobial resistance problem. All these plant species have already been incorporated in traditional medications due to their potential anti-inflammatory, antimicrobial, antioxidant, and anti-cancer properties. The antimicrobial activities of the above four EOs were screened against methicillin-sensitive S. aureus (MSSA), MRSA, and the reference strain S. aureus ATCC 29213 applying the Kirby–Bauer disc diffusion and broth microdilution methods. The modified microtiter plate biofilm assay was also performed to assess the biofilm formation ability of tested strains, and the anti-biofilm activity of EOs, as well as reference antimicrobials. Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis) ATCC 12228 and S. epidermidis 35984 were used as negative and positive quality control strains, respectively, for this bioassay. Penicillin, enrofloxacin, gentamicin sulfate, tetracycline hydrochloride, and cefaclor were examined as reference antimicrobials in this context. The observed bacterial growth inhibition varied significantly depending on the type and concentration of the antimicrobials. Thymus sibthorpii EO was determined as the strongest antimicrobial, with 0.091 mg/mL minimum inhibitory concentration (MIC) and a 14–33 mm diameter inhibition zone at 5% (v/v) concentration. All tested EOs indicated almost 95% inhibition of biofilm formation at their half MIC, while gentamicin sulfate did not show sufficient anti-biofilm activity. None of the methicillin-resistant strains showed resistance to the EOs compared to methicillin-sensitive strains. Thus, Thymus sibthorpii and Origanum vulgare EOs might be determined potential antimicrobial agent alternatives to overcome the problem of microbial resistance. Although the strong antimicrobial activity of Thymus sibthorpii EO was revealed in the first experimental chapter of this study, a type of administration is needed via a biomaterial system, because of the high sensitivity and volatility of EO. Among a wide variety of biomaterial formulations, collagen hydrogels have been reported as particularly effective for incorporating essential oils to use in tissue engineering applications. On the other hand, to our best knowledge, Thymus sibthorpii EO has not been introduced yet within medical devices in the field of tissue engineering applications according to the literature. Collagen, a fibrous, non-soluble protein, is one of the most prominent polymers for the development of antimicrobial biomaterials, attributable to its superior biocompatibility, excellent biodegradability, hydrophilic nature, reduced cytotoxicity, and high cell attachment affinity. Nevertheless, the fabricated forms of collagen need to be functionalized via in situ crosslinking due to a lack of stability. Since physical and biological crosslinking mechanisms have generally resulted in low crosslinking efficacy, carboxyl, and amine terminal crosslinking strategies are favored in research, as arises in literature. Among the above, since carbodiimide and glutaraldehyde often cause cytotoxicity, alternative crosslinkers such as multi-arm, star-shaped poly(ethylene glycol) succinimidyl glutarate (starPEG) have emerged as the subject of research. At the second experimental part of this study, at first crosslinking efficiency was screened. For this purpose, 300 μl collagen type I hydrogels crosslinked with six different starPEG molecules were developed and optimized, followed by assessment of free amine content of the hydrogels using TNBSA assay, and evaluation of their enzymatic degradation profile using collagenase assay. Furthermore, the optimally starPEG-crosslinked collagen hydrogels were loaded with several concentrations (0.5, 1, 2% v/v) of Thymus sibthorpii EO and the release profile and kinetics of the EO were investigated. For this purpose, the fabricated EO-loaded hydrogels were soaked into 1 mL of 1x PBS (pH 7.4) at 37 C using a horizontal shaker incubator. At each defined time point (0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 24, and 48 h), 100 μL of sample was removed and replaced by 100 μL fresh 1x PBS. The linear calibration curve was prepared with different concentrations of Thymus sibthorpii EO using 70% v/v ethanol, which was used as a solvent. Then, the absorbance of the supernatant was measured at 365 nm and the concentration of the released Thymus sibthorpii EO was determined by using the standard curve to find where their concentration corresponds. After spectrophotometric evaluation, the cumulative release percentage of EO was estimated. Furthermore, we studied the release kinetics according to the release profile of Thymus sibthorpii EO. Hence, the zero-order, first-order, Higuchi, Korsmeyer-Peppas, and Hixon-Crowell release kinetics models have been applied to post-burst-release data. Finally, the antimicrobial activity of the developed composite hydrogels was assessed against S. aureus, and Escherichia coli (E. coli) using Kirby-Bauer disc diffusion method, whilst their cytocompatibility and cytotoxicity was examined on NIH-3T3 fibroblast cell line by alamarBlue cell viability assay, and Quant-iT PicoGreen dsDNA cell proliferation assay.starPEG-crosslinked collagen type I hydrogels presented significantly decreased free amine content for all types of crosslinkers with all tested concentrations compared to non-crosslinked hydrogels (p < 0.05). An effective plateau was observed between 0.5 and 2 mM, and no statistical difference was noted among 0.5 mM, 1 mM, and 2 mM crosslinked hydrogels (p < 0.05). In this plateau, the free amine reduction percentage was between 44.82% and 58.57%. Non-crosslinked hydrogels were completely degraded within a couple of hours. In general perspective, scaffolds showed higher resistance to degradation when crosslinked with glutaraldehyde (GTA), that was used as a positive control. However, hydrogels crosslinked with 0.5 mM of 4SP, pentaerythritol, 10 kDa showed no statistical difference compared to GTA crosslinked hydrogels, whilst 0.5 mM of 4SP, pentaerythritol, 20 kDa, and 8SP, hexaglycerol, 20 kDa displayed the lowest significant difference than all other groups (p < 0.05). Therefore, 0.5 mM of the above three crosslinkers were deemed to be optimal conditions for functionalizing collagen hydrogels. The non-crosslinked hydrogels demonstrated burst release and completely released EO within a couple of hours was observed. Although GTA crosslinked scaffolds released almost all loaded quantity of the EO at 0.5% v/v from the polymeric network, the chosen optimized hydrogels crosslinked with 0.5 mM of 4SP, pentaerythritol, 10 kDa, 4SP, pentaerythritol, 20 kDa and 8SP, hexaglycerol, 20 kDa, released 63.92 3.31%, 75.85 9.00% and 57.82 4.08% of the EO loaded at the same concentration after 48 h. Moreover, the release kinetics was studied by applying five different mathematical models. Hixson-Crowell model did not fit any of the experimental groups, whilst the other four models fitted to different experimental groups. On the other hand, the release exponent (n) values evaluated by the Korsmeyer-Peppas model indicated that the release mechanism of EO from crosslinked hydrogels obeyed the Fickian diffusion. 0.5% v/v EO-loaded collagen type I hydrogels showed adequate antibacterial activity against S. aureus. More specifically, hydrogels crosslinked with 0.5 mM 4SP, pentaerythritol, 10 kDa and loaded with 0.5 v% EO demonstrated 2.83 0.47 cm, and 1.23 0.15 cm inhibition zone diameter against S. aureus, and E. coli, respectively. Moreover, hydrogels containing 0.5% v/v of EO, which was the minor concentration, did not show a statistical difference regarding their antimicrobial activity compared to positive control penicillin (for gram-positive bacteria), and enrofloxacin (for gram-negative bacteria) (p < 0.05). Hence, 0.5% v/v concentration of Thymus sibthorpii EO was chosen as the optimal concentration to incorporate into collagen scaffolds. According to cell metabolic activity and proliferation studies, none of the fabricated hydrogels showed any toxicity on ΝΙΗ-3Τ3 fibroblast cell line (p < 0.05).In the quest for alternative antibacterial therapies, herein, we developed collagen type I hydrogel systems optimally crosslinked and loaded with Thymus sibthorpii essential oil. The proposed antimicrobial agent incorporated into the collagen type I scaffolds showed strong activity against S. aureus, demonstrated a sustained release profile, and had no toxicity on fibroblasts. Collectively, the outcomes obtained highlight the importance of Thymus sibthorpii essential oil incorporated in collagen type I hydrogels, as an effective and alternative antibacterial therapy for regenerative medicine and tissue engineering purposes and for the reduction of the possible antimicrobial resistance.

Η αυξημένη κατανάλωση και η ακατάλληλη χρήση αντιμικροβιακών παραγόντων τόσο στους ανθρώπους όσο και στα ζώα έχουν συνεισφέρει στην εξάπλωση της μικροβιακής αντοχής, η οποία απειλεί σοβαρά τη δημόσια υγεία και την υγεία των ζώων. Ενώ οι λοιμώξεις που οφείλονται σε μικροβιακή αντοχή των βακτηρίων μπορεί να είναι προσαρμοστικές, εγγενείς ή επίκτητες, τα πολυανθεκτικά βακτήρια (π.χ., ο ανθεκτικός στη μεθικιλλίνη Staphylococcus aureus) προκαλούν λοιμώξεις που οδηγούν σε μεγαλύτερες περιόδους νοσηλείας, σημαντική νοσηρότητα και θνησιμότητα, καθώς και υψηλό κόστος υγειονομικής περίθαλψης. Σύμφωνα με έκθεση του Οργανισμού Οικονομικής Συνεργασίας και Ανάπτυξης (ΟΟΣΑ), περίπου 2,4 εκατομμύρια άνθρωποι αναμένεται να πεθάνουν λόγω αυτού του είδους των λοιμώξεων στη Βόρεια Αμερική, την Αυστραλία και την Ευρώπη κατά τις επόμενες τρεις δεκαετίες, ενώ η θεραπεία μπορεί να κοστίσει έως και 3,5 δισεκατομμύρια δολάρια ΗΠΑ ετησίως. Γενικά, ο S. aureus είναι ένας από τους κύριους ευκαιριακούς παθογόνους μικροοργανισμούς στον άνθρωπο, που μπορεί να διαφεύγει από το ανοσοποιητικό σύστημα. Μεταξύ της μεγάλης ποικιλίας λοιμώξεων, ο S. aureus είναι ένα γνωστό βακτήριο που σχετίζεται με μολύνσεις τραυμάτων, αποικίζοντας συνήθως το επιφανειακό στρώμα των τραυμάτων. Συγκεκριμένα, οι λοιμώξεις που προκαλούνται από τον S. aureus μπορεί να αξιολογηθούν ως ένας πιθανός παράγοντας κινδύνου για ανησυχία σχετικά με τον ανθεκτικό στη μεθικιλλίνη S. aureus (methicillin-resistant S. aureus, MRSA), γεγονός που έχει οδηγήσει στην ανάγκη για ανάπτυξη εναλλακτικών αντιμικροβιακών, υποκατάστατων των παραδοσιακών αντιβιοτικών. Επιπλέον, ο S. aureus (ιδιαίτερα ο MRSA) έχει την ικανότητα να προσκολλάται σε ζωντανές ή αδρανείς επιφάνειες, εκκρίνοντας μια εξωκυτταρική πολυμερική ουσία που αποτελείται από πρωτεΐνες, πολυσακχαρίτες, νουκλεϊκά οξέα και νερό, γνωστή ως βιοϋμένιο (biofilm). Στη συνέχεια, η μήτρα του βιοϋμενίου δρα ως φυσικό εμπόδιο, αποτρέποντας τη διείσδυση του φαρμάκου στην βακτηριακή κοινότητα και βοηθώντας τον μικροοργανισμό να αντιστέκεται και να ελαχιστοποιεί την επίδραση των χορηγούμενων αντιβιοτικών σε αυτήν. Αυτές οι προκλήσεις έχουν προκαλέσει σημαντικό ενδιαφέρον στην επιστημονική κοινότητα για την ανάπτυξη θεραπευτικών προσεγγίσεων με βάση δραστικές ενώσεις φαρμακευτικών/αρωματικών φυτών, που επιδεικνύουν αντιμικροβιακή δράση (αιθέρια έλαια), ως μια ασφαλέστερη και πιο φιλική προς το περιβάλλον εναλλακτική προσέγγιση στα αντιβιοτικά. Τα αιθέρια έλαια (Essential Oils, EOs) είναι έγχρωμα, αρωματικά, πολύπλοκα υδρόφοβα υγρά, γνωστά επίσης ως πτητικά έλαια. Ορίζονται ως το δευτερεύον μεταβολικό προϊόν των αρωματικών φυτών και βρίσκονται σε διάφορα μέρη των φυτών, όπως τα άνθη, οι ρίζες, οι φλοιοί, οι μίσχοι, τα φύλλα και οι σπόροι. Τα αιθέρια έλαια μπορούν να αποτελέσουν δυνητικά εναλλακτικούς παράγοντες ώστε η χρήση τους να μειώσει την μικροβιακή αντοχή λόγω των σημαντικών θεραπευτικών τους ιδιοτήτων (αντιβακτηριακή, αντισηπτική και αντιοξειδωτική δράση). Για αυτόν τον λόγο, τα αιθέρια έλαια από φαρμακευτικά φυτά έχουν επίσης μελετηθεί ως ισχυροί αντιμικροβιακοί παράγοντες στα συστήματα εκτροφής ζώων. Η αντιμικροβιακή δράση των αιθέριων ελαίων δεν προέρχεται μόνο από την ποιοτική χημική τους σύνθεση, αλλά και από την ποσοτική ένταση κάθε συστατικού που περιλαμβάνεται στη σύστασή τους, όπως και όλων των δραστικών ουσιών που περιέχονται στο φυτικό είδος. Η πολύπλοκη σύνθεσή τους περιλαμβάνει κυρίως τερπένια (συνήθως μονοτερπένια και σεσκιτερπένια) και τερπενοειδή. Παρόλο που ορισμένες από αυτές τις χημικές ουσίες είναι υδατοδιαλυτές, οι περισσότερες είναι υδρόφοβες, συνεπώς τα αιθέρια έλαια ορίζονται γενικά ως υδρόφοβα. Στην παρούσα μελέτη, τα αιθέρια έλαια των φυτών Thymus sibthorpii, Origanum vulgare, Salvia fruticosa και Crithmum maritimum επιλέχθηκαν ως πιθανοί αντιμικροβιακοί παράγοντες κατά διαφόρων στελεχών του S. aureus, για την αντιμετώπιση του προβλήματος της μικροβιακής αντοχής. Όλα αυτά τα είδη έχουν ήδη χρησιμοποιηθεί σε παραδοσιακές θεραπείες λόγω των πιθανών αντιφλεγμονωδών, αντιμικροβιακών, αντιοξειδωτικών και αντικαρκινικών ιδιοτήτων τους. Η αντιμικροβιακή δραστικότητα των τεσσάρων αιθέριων ελαίων ελέγχθηκε κατά των στελεχών του ευαίσθητου στη μεθικιλλίνη S. aureus (methicillin-sensitive S. aureus, MSSA), του ανθεκτικού στη μεθικιλλίνη S. aureus (MRSA) και του στελέχους αναφοράς S. aureus ATCC 29213 εφαρμόζοντας τη μέθοδο διάχυσης δίσκου Kirby–Bauer και τη μέθοδο μικροαραιώσεων σε θρεπτικό υλικό. Επίσης, πραγματοποιήθηκε η τροποποιημένη μέθοδος μικροτιτλοδότησης για την αξιολόγηση της ικανότητας σχηματισμού βιοϋμενίου των εξεταζόμενων στελεχών, καθώς και της αντιβιοϋμενιακής δράσης των αιθέριων ελαίων, όπως και των αντιμικροβιακών παραγόντων αναφοράς. Οι Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis) ATCC 12228 και ο S. epidermidis 35984 χρησιμοποιήθηκαν αντίστοιχα ως αρνητικά και θετικά στελέχη αναφοράς για τον ποιοτικό έλεγχο στην βιοδοκιμή. Η πενικιλλίνη, η ενροφλοξασίνη, η θειϊκή γενταμυκίνη, η υδροχλωρική τετρακυκλίνη και η κεφακλόρη εξετάστηκαν ως αντιμικροβιακοί παράγοντες αναφοράς στον συγκεκριμένο πειραματισμό. Η παρατηρούμενη αναστολή της βακτηριακής ανάπτυξης διέφερε σημαντικά ανάλογα με τον τύπο και τη συγκέντρωση των αντιμικροβιακών παραγόντων. Το αιθέριο έλαιο του Thymus sibthorpii καθορίστηκε ως το ισχυρότερο σε αντιμικροβιακή δράση, με ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση (minimum inhibitory concentration, MIC) στα 0,091 mg/mL και ζώνη αναστολής διαμέτρου 14–33 mm σε συγκέντρωση 5% (v/v). Όλα τα εξεταζόμενα αιθέρια έλαια έδειξαν σχεδόν 95% αναστολή του σχηματισμού βιοϋμενίου στο 50% της MIC τους, ενώ η θειϊκή γενταμυκίνη δεν παρουσίασε επαρκή αντιβιοϋμενιακή δράση. Κανένα από τα ανθεκτικά στη μεθικιλλίνη στελέχη δεν έδειξε αντοχή στα αιθέρια έλαια σε σύγκριση με τα ευαίσθητα στη μεθικιλλίνη στελέχη. Συνεπώς, τα αιθέρια έλαια του Thymus sibthorpii και του Origanum vulgare θα μπορούσαν να προσδιοριστούν ως πιθανοί εναλλακτικοί αντιμικροβιακοί παράγοντες για την αντιμετώπιση του προβλήματος της μικροβιακής αντοχής. Αν και η ισχυρή αντιμικροβιακή δράση του αιθέριου ελαίου του Thymus sibthorpii αποκαλύφθηκε στο πρώτο πειραματικό κεφάλαιο της διατριβής, στο δεύτερο διερευνήθηκε ο τρόπος χορήγησης των αιθέριων ελαίων μέσω εγκλεισμού σε διαφορετικές κατηγορίες βιοϋλικών λόγω της υψηλής ευαισθησίας και πτητικότητας του αιθέριου ελαίου. Μεταξύ ποικίλων βιοϋλικών, τα υδροπηκτώματα κολλαγόνου έχουν αναφερθεί ως ιδιαίτερα αποτελεσματικά για την ενσωμάτωση αιθέριων ελαίων σε εφαρμογές που σχετίζονται με την αναγεννητική ιστών. Από την άλλη πλευρά, σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, το αιθέριο έλαιο του Thymus sibthorpii δεν έχει έως σήμερα ενσωματωθεί σε βιοϋλικά που να χρησιμοποιούνται στον τομέα της μηχανικής και αναγεννητικής ιστών. Το κολλαγόνο, μια ινώδης, μη διαλυτή πρωτεΐνη, είναι ένα από τα πλέον σημαντικά πολυμερή για την ανάπτυξη αντιμικροβιακών βιοϋλικών, λόγω της εξαιρετικής βιοσυμβατότητάς του, της άριστης βιοαποδομησιμότητας, της υδρόφιλης φύσης του, της μειωμένης κυτταροτοξικότητας και της υψηλής συγγένειας στην κυτταρική του πρόσδεση. Ωστόσο, οι παρασκευασμένες μορφές κολλαγόνου χρειάζονται «ενεργοποίηση» μέσω in situ διασύνδεσης (crosslinking) λόγω έλλειψης σταθερότητας. Δεδομένου ότι οι φυσικοί και βιολογικοί μηχανισμοί διασύνδεσης έχουν γενικά χαμηλή αποτελεσματικότητα, οι στρατηγικές crosslinking των καρβοξυλικών και αμινικών άκρων προτιμώνται στην έρευνα, όπως προκύπτει από τη βιβλιογραφία. Μεταξύ αυτών, καθώς οι καρβοδιιμίδες και η γλουταραλδεΰδη προκαλούν συχνά κυτταροτοξικότητα, έχουν αναδειχθεί εναλλακτικοί παράγοντες διασύνδεσης, όπως η πολύ βραχιονική, αστροειδούς σχήματος πολυ(αιθυλενογλυκόλη) σουκινιμιδυλική γλουταραλδεΰδη (starPEG), ως αντικείμενο έρευνας για την πειραματική μας δομή.Στο δεύτερο πειραματικό μέρος αυτής της μελέτης, αρχικά εξετάστηκε η αποτελεσματικότητα της διασύνδεσης. Για το σκοπό αυτό, αναπτύχθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν υδροπηκτώματα κολλαγόνου τύπου Ι, όγκου 300 μl, με διασύνδεση με έξι διαφορετικά μόρια starPEG, και ακολούθησε αξιολόγηση της περιεκτικότητας σε ελεύθερη αμίνη των υδροπηκτωμάτων χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία TNBSA και αξιολόγηση του προφίλ ενζυμικής αποικοδόμησής τους χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία κολλαγενάσης. Στη συνέχεια, στα υδροπηκτώματα κολλαγόνου, που βελτιστοποιήθηκαν με τη διασύνδεση με starPEG ενσωματώθηκαν διάφορες συγκεντρώσεις (0,5, 1, 2% v/v) αιθέριου ελαίου Thymus sibthorpii (EO) και διερευνήθηκαν το προφίλ απελευθέρωσης και η κινητική του αιθέριου ελαίου (EO). Για αυτόν τον σκοπό, τα παρασκευασμένα υδροπηκτώματα που περιείχαν EO τοποθετήθηκαν σε 1 mL διαλύματος PBS 1x (pH 7,4) στους 37°C, χρησιμοποιώντας έναν οριζόντιο αναδευτήρα-επωαστήρα. Σε κάθε καθορισμένο χρονικό σημείο (0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 24 και 48 ώρες), αφαιρούνταν 100 μL του δείγματος και αντικαθίσταντο με 100 μL φρέσκου διαλύματος PBS 1x. Η γραμμική καμπύλη βαθμονόμησης παρασκευάστηκε με διαφορετικές συγκεντρώσεις EO Thymus sibthorpii, χρησιμοποιώντας 70% v/v αιθανόλη ως διαλύτη. Στη συνέχεια, η απορρόφηση του υπερκείμενου διαλύματος μετρήθηκε στα 365 nm και η συγκέντρωση του απελευθερωμένου EO υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την πρότυπη καμπύλη για να προσδιοριστεί το σημείο αντιστοιχίας της συγκέντρωσης. Μετά τη φασματοφωτομετρική αξιολόγηση, εκτιμήθηκε το ποσοστό σωρευτικής απελευθέρωσης του EO. Επιπλέον, μελετήθηκε η κινητική απελευθέρωσης σύμφωνα με το προφίλ απελευθέρωσης του EO Thymus sibthorpii. Συνεπώς, τα μοντέλα κινητικής απελευθέρωσης μηδενικής τάξης, πρώτης τάξης, Higuchi, Korsmeyer-Peppas και Hixon-Crowell εφαρμόστηκαν στα δεδομένα μετά την αρχική ριπή απελευθέρωσης. Τέλος, η αντιμικροβιακή δραστικότητα των αναπτυγμένων σύνθετων υδροπηκτωμάτων αξιολογήθηκε κατά του S. aureus και της Escherichia coli (E. coli), χρησιμοποιώντας τη μέθοδο διάχυσης δίσκου Kirby-Bauer, ενώ η κυτταροσυμβατότητα τους και η κυτταροτοξικότητα τους αξιολογήθηκε σε κυτταρικές σειρές ινοβλαστών NIH-3T3 με τη δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων alamarBlue και τη δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA. Τα υδροπηκτώματα κολλαγόνου τύπου I, διασυνδεδεμένα με starPEG, παρουσίασαν σημαντικά μειωμένη περιεκτικότητα σε ελεύθερες αμίνες για όλους τους τύπους των παραγόντων διασύνδεσης και όλες τις δοκιμασμένες συγκεντρώσεις, σε σύγκριση με τα μη διασυνδεδεμένα υδροπηκτώματα (p < 0,05). Ένα αποτελεσματικό πλατό παρατηρήθηκε μεταξύ 0,5 και 2 mM, χωρίς στατιστική διαφορά μεταξύ των υδροπηκτωμάτων διασυνδεδεμένων με 0,5 mM, 1 mM και 2 mM (p < 0,05). Στο πλατό αυτό, το ποσοστό μείωσης των ελεύθερων αμινών κυμαινόταν μεταξύ 44,82% και 58,57%. Τα μη διασυνδεδεμένα υδροπηκτώματα αποδομήθηκαν πλήρως μέσα σε λίγες ώρες. Από γενική άποψη, τα ικριώματα (scaffolds) των υδροπηκτωμάτων έδειξαν υψηλότερη αντοχή στην αποδόμηση όταν διασυνδέθηκαν με γλουταραλδεΰδη (GTA), η οποία χρησιμοποιήθηκε ως θετικό κοντρόλ. Ωστόσο, τα υδροπηκτώματα που διασυνδέθηκαν με 0,5 mM 4SP, πενταερυθριτόλη, 10 kDa δεν παρουσίασαν στατιστική διαφορά σε σύγκριση με τα υδροπηκτώματα διασταυρωμένα με GTA, ενώ τα 0,5 mM 4SP, πενταερυθριτόλη, 20 kDa και 8SP, εξαγλυκερόλη, 20 kDa εμφάνισαν τη χαμηλότερη σημαντική διαφορά σε σχέση με όλες τις άλλες ομάδες (p < 0,05). Συνεπώς, τα 0,5 mM από τους παραπάνω τρεις παράγοντες διασύνδεσης θεωρήθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες για τη λειτουργική τροποποίηση των υδροπηκτωμάτων κολλαγόνου. Τα μη διασυνδεδεμένα υδροπηκτώματα παρουσίασαν αρχική έντονη απελευθέρωση και ολοκλήρωσαν την απελευθέρωση του EO μέσα σε λίγες ώρες. Αν και τα ικριώματα του κολλαγόνου που διασυνδέθηκαν με GTA απελευθέρωσαν σχεδόν όλη την ενσωματωμένη ποσότητα EO σε συγκέντρωση 0,5% v/v από το πολυμερικό δίκτυο, τα επιλεγμένα βελτιστοποιημένα υδροπηκτώματα που διασυνδέθηκαν με 0,5 mM 4SP, πενταερυθριτόλη, 10 kDa, 4SP, πενταερυθριτόλη, 20 kDa και 8SP, εξαγλυκερόλη, 20 kDa, απελευθέρωσαν 63,92 ± 3,31%, 75,85 ± 9,00% και 57,82 ± 4,08% του ενσωματωμένου EO στην ίδια συγκέντρωση μετά από 48 ώρες. Επιπλέον, μελετήθηκε η κινητική της απελευθέρωσης εφαρμόζοντας πέντε διαφορετικά μαθηματικά μοντέλα. Το μοντέλο Hixson-Crowell δεν ταίριαξε σε καμία από τις πειραματικές ομάδες, ενώ τα άλλα τέσσερα μοντέλα ταίριαξαν σε διαφορετικές πειραματικές ομάδες. Από την άλλη πλευρά, οι τιμές του εκθέτη απελευθέρωσης (n) που αξιολογήθηκαν μέσω του μοντέλου Korsmeyer-Peppas έδειξαν ότι ο μηχανισμός απελευθέρωσης του EO από τα διασυνδεδεμένα υδροπηκτώματα ακολουθεί τη διάχυση Fickian. Τα υδροπηκτώματα κολλαγόνου τύπου I με φορτωμένο EO σε συγκέντρωση 0,5% v/v έδειξαν επαρκή αντιβακτηριακή δράση κατά του S. aureus. Πιο συγκεκριμένα, τα υδροπηκτώματα που διασυνδέθηκαν με 0,5 mM 4SP, πενταερυθριτόλη, 10 kDa και φορτώθηκαν με 0,5% v/v EO, παρουσίασαν ζώνη αναστολής με διάμετρο 2,83 ± 0,47 cm και 1,23 ± 0,15 cm κατά των S. aureus και E. coli, αντίστοιχα. Επιπλέον, τα υδροπηκτώματα που περιείχαν 0,5% v/v EO, που ήταν η μικρότερη συγκέντρωση, δεν παρουσίασαν στατιστική διαφορά ως προς την αντιμικροβιακή τους δράση σε σύγκριση με την πενικιλίνη που ήταν το θετικό κοντρόλ (για τα gram-θετικά βακτήρια) και την ενροφλοξασίνη (για τα gram-αρνητικά βακτήρια) αντίστοιχα (p < 0,05). Συνεπώς, η συγκέντρωση 0,5% v/v του EO Thymus sibthorpii επιλέχθηκε ως η βέλτιστη συγκέντρωση για ενσωμάτωσή του στα ικριώματα του κολλαγόνου. Σύμφωνα με τις μελέτες μεταβολικής δραστηριότητας και πολλαπλασιασμού κυττάρων, κανένα από τα διασυνδεδεμένα υδροπηκτώματα δεν παρουσίασε τοξικότητα στην κυτταρική σειρά ινοβλαστών ΝΙΗ-3Τ3 που χρησιμοποιήθηκε (p < 0,05). Στο πλαίσιο της αναζήτησης εναλλακτικών αντιβακτηριακών θεραπειών, στην παρούσα μελέτη αναπτύχθηκαν συστήματα υδροπηκτωμάτων κολλαγόνου τύπου I, διασυνδεδεμένα και βελτιστοποιημένα που εμπεριείχαν το αιθέριο έλαιο του Thymus sibthorpii. Το προτεινόμενο αιθέριο έλαιο που ενσωματώθηκε στα ικριώματα κολλαγόνου τύπου I παρουσίασε ισχυρή αντιβακτηριδιακή δράση κατά του S. aureus, εμφάνισε προφίλ συνεχούς απελευθέρωσης, ενώ δεν παρουσίασε τοξικότητα στους ινοβλάστες. Συνολικά, τα αποτελέσματα που προέκυψαν είναι πρωτοποριακά, καθώς παρέχουν τη δυνατότητα χρήσης του αιθέριου ελαίου Thymus sibthorpii που έχοντας ενσωματωθεί σε υδροπηκτώματα κολλαγόνου τύπου I που έχουν βελτιστοποιηθεί με διασύνδεση με το starPEG, επιδεικνύει αποτελεσματική αντιβακτηριδιακή δράση κατά μικροβιακών στελεχών που εμπλέκονται σε τραύματα ιστών, όντας εναλλακτική θεραπεία για σκοπούς αναγεννητικής ιατρικής και μηχανικής ιστών με στόχο τη μείωση της μικροβιακής αντοχής.