Proteomic changes in aqueous humour, lens capsule and crystalline lens in patients with cataract

Abstract

Introduction: This is a basic science research proteomic study. The study took place at the 1st University Ophthalmology Department, ‘G.Gennimatas’ General Hospital of Athens in collaboration with B.S.R.C “Alexander Fleming” in Vari, Attiki. The study was conducted from March 2022 until February 2025. Objectives: The aim of the present study is to investigate and identify proteomic changes and corresponding signaling pathways involved in the formation of age-related, diabetic, and post-vitrectomy cataracts by analyzing three distinct sample types from each participant: the aqueous humour, the anterior capsule, and the content of the phaco cassette, which contains the lens fragments. First, proteomic changes and the associated signaling pathways in the aqueous humour will be compared across the three cataract groups (age-related, diabetic, and post-vitrectomy), with the objective of identifying both common and distinct cataract-specific mechanisms. Next, the proteomic alterations and associated signaling pathways in the anterior capsule will be examined and compared between the different cataract types. Finally, a novel analytical method will be developed to examine the contents of the phaco cassette, which contains lens fragments collected during cataract surgery. This method will allow for the identification of proteomic changes and relevant signaling pathways in the lens across the three cataract types. In addition to the proteomic analyses, demographic data from each participant will be collected and analyzed to investigate potential risk factors and correlations with the significant pathways identified. Material and methods: All patients presented with cataract at the 1st University Ophthalmology Department in ‘G.Gennimatas’ General Hospital of Athens were eligible to the study. Three cataract groups were organized and each participant was assigned to a specific group based on certain criteria. The three cataract groups were the age-related cataract (ARC) group (No history of diabetes mellitus and age older than 75 years); the diabetic cataract (DC) group (History of diabetes mellitus and age younger than 65 years); and the post-vitrectomy cataract (PVC) group (Previous vitrectomy surgery for retinal detachment repair with gas tamponade in the past 12 months and no history of diabetes mellitus). Every participant included in the study filled in a questionnaire. Three samples were collected during routine cataract surgery, performed by the same experienced surgeon under local anesthesia; the aqueous humour, the anterior capsule and the content of the phaco cassette bag. Sp3 protocol (Single-Pot, Solid-Phase, Sample-Preparation) was used for the sample preparation. The recognition and quantification of proteins were carried out with liquid chromatography online with tandem mass spectrometry, using a Q Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap mass spectrometer. The DIA-NN software was applied for identification and quantification of peptides/proteins. The software Perseus (Version 1.6.15.0) was used for statistical analysis (defined groups, t-test) and data visualization. Two-sample t-tests were conducted to compare ARC-DC and ARC-PVC groups. Volcano plots were generated to visualize the t-test results. ANOVA tests were performed for comparisons across all groups, with the results visualized in heatmaps. For gene enrichment analysis ShinyGO (Version 0.77) was used. All analyses of demographic data were carried out using the R programming language and the RStudio IDE. Results: A very rich atlas of the lens and aqueous humour proteome has been generated. In this study, a total of 1639 proteins were identified in the aqueous humour samples, 2815 proteins in the anterior capsule samples, and 2975 proteins in the phaco cassette content samples. Glycosaminoglycan biosynthesis and non-canonical Wnt receptor signaling pathway were significantly differentially expressed in the ARC group compared to both DC and PVC groups. In the PVC group, complement activation was differentially expressed in the aqueous humour samples, while glutathione metabolism and oxidoreductase activity were differentially expressed in the anterior capsule samples. Microfilament motor activity, microtubule cytoskeleton organization, and microtubule binding were differentially expressed in DC and PVC groups in both aqueous humour and anterior capsule samples. In the phaco cassette content samples, proteins with significantly different expression in the ARC group compared to DC and PVC groups were involved in pathways, including actin binding, actin cytoskeleton reorganization, actin filament capping, cortical actin cytoskeleton organization, and small GTPase-mediated signal transduction pathways. In the phaco cassette content samples, pathways significantly differentially expressed in the ARC group to the DC and PVC groups included the glycolipid metabolic, glycosphingolipid biosynthetic, and glycosphingolipid metabolic processes, with GLA being among the most significant proteins in the ARC group. Similarly, in the anterior capsule samples, the main significantly differentially expressed pathways in the ARC group compared to the DC and PVC groups were the glycolipid metabolic, glycosphingolipid biosynthetic, and glycosphingolipid metabolic processes, with ST3GAL5 being among the most significant proteins in the ARC group. Conclusions: The results of this study expand the existing knowledge on pathways involved in the pathophysiology of cataract. In this study, key pathways involved in cataract formation in age-related, diabetic, and post-vitrectomy cataracts were identified. Differential expression of the non-canonical Wnt receptor signaling pathway in the age-related cataract may promote abnormal proliferation and migration of lens epithelial cells, contributing to cataract formation. Similarly, the differential expression of glycosaminoglycan and glycosphingolipid pathways in the ARC group suggests potential therapeutic targets for preventing cell proliferation and repairing damaged lens tissue. In the PVC group, the significant differential expression of oxidation-reduction pathways in anterior capsule samples suggests a protective role of lens epithelial cells against oxidative stress. However, post-vitrectomy cataract formation may occur when oxidative stress surpasses protective mechanisms. This is the first study to use phaco cassette content samples to investigate cataract formation, opening new avenues for research. Our results highlight novel pathways involved in cataract pathophysiology and suggest druggable targets for slowing or preventing cataract progression. Future research should focus on identifying diagnostic biomarkers and developing a grading system for cataract severity.

Εισαγωγή: Η παρούσα μελέτη είναι μια πρωτεωμική μελέτη βασικών επιστημών. Διεξήχθη στην Α΄ Πανεπιστημιακή Οφθαλμολογική Κλινική του Γενικού Νοσοκομείου Αθηνών «Γ. Γεννηματάς», σε συνεργασία με το Ινστιτούτο Βιοϊατρικών Ερευνών «Αλέξανδρος Φλέμινγκ» στη Βάρη Αττικής. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε από τον Μάρτιο του 2022 έως τον Φεβρουάριο του 2025. Σκοπός: Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση και η ταυτοποίηση των πρωτεωμικών μεταβολών και των αντίστοιχων σηματοδοτικών οδών που εμπλέκονται στη δημιουργία του γεροντικού, διαβητικού και μετα-υαλοειδεκτομής καταρράκτη, μέσω ανάλυσης τριών διαφορετικών τύπων δειγμάτων από κάθε συμμετέχοντα: του υδατοειδούς υγρού, του προσθίου περιφακίου και του περιεχομένου της κασέτας φακοθρυψίας, το οποίο περιέχει θραύσματα του φακού. Αρχικά, οι πρωτεωμικές μεταβολές και οι αντίστοιχες σηματοδοτικές οδοί στο υδατοειδές υγρό θα συγκριθούν μεταξύ των τριών ομάδων καταρράκτη (γεροντικού, διαβητικού και μετα-υαλοειδεκτομής), με στόχο τον εντοπισμό τόσο κοινών όσο και διαφορετικών μηχανισμών που σχετίζονται με τον καταρράκτη. Στη συνέχεια, θα εξεταστούν και θα συγκριθούν οι πρωτεωμικές μεταβολές και οι αντίστοιχες σηματοδοτικές οδοί στο πρόσθιο περιφάκιο των τριών διαφορετικών τύπων καταρράκτη. Τέλος, θα αναπτυχθεί μια νέα αναλυτική μέθοδος για την εξέταση του περιεχομένου της κασέτας φακοθρυψίας, η οποία θα επιτρέψει την ταυτοποίηση πρωτεωμικών μεταβολών και των σχετικών σηματοδοτικών οδών στον φακό μεταξύ των τριών τύπων καταρράκτη. Εκτός από τις πρωτεωμικές αναλύσεις, θα συλλεγούν και θα αναλυθούν δημογραφικά δεδομένα από κάθε συμμετέχοντα, προκειμένου να διερευνηθούν πιθανοί παράγοντες κινδύνου και συσχετίσεις με τις σημαντικές σηματοδοτικές οδούς που θα ταυτοποιηθούν. Υλικό και Μέθοδος: Υποψήφιοι για συμμετοχή στη μελέτη ήταν όλοι οι ασθενείς που προσήλθαν με καταρράκτη στην Α΄ Πανεπιστημιακή Οφθαλμολογική Κλινική του Γενικού Νοσοκομείου Αθηνών «Γ. Γεννηματάς». Οργανώθηκαν τρεις ομάδες καταρράκτη και κάθε συμμετέχων εντάχθηκε σε μια συγκεκριμένη ομάδα με βάση ορισμένα κριτήρια. Οι τρεις ομάδες ήταν: η ομάδα γεροντικού καταρράκτη (ARC) (χωρίς ιστορικό σακχαρώδους διαβήτη και ηλικία άνω των 75 ετών), η ομάδα διαβητικού καταρράκτη (DC) (με ιστορικό σακχαρώδους διαβήτη και ηλικία μικρότερη των 65 ετών), και η ομάδα καταρράκτη μετά από υαλοειδεκτομή (PVC) (χωρίς ιστορικό σακχαρώδους διαβήτη και ιστορικό προηγούμενης χειρουργικής επέμβασης υαλοειδεκτομής για αποκατάσταση αποκόλλησης αμφιβληστροειδούς με επιπωματισμό με αέριο εντός των τελευταίων 12 μηνών). Κάθε συμμετέχων στη μελέτη συμπλήρωσε ένα ερωτηματολόγιο. Κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης καταρράκτη, που πραγματοποιήθηκε από τον ίδιο έμπειρο χειρουργό υπό τοπική αναισθησία, συλλέχθηκαν τρία δείγματα: το υδατοειδές υγρό, το πρόσθιο περιφάκιο και το περιεχόμενο της κασέτας φακοθρυψίας. Για την προετοιμασία των δειγμάτων εφαρμόστηκε το πρωτόκολλο Sp3 (Single-Pot, Solid-Phase, Sample-Preparation). Η αναγνώριση και η ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκαν με υγρή χρωματογραφία σε σύνδεση με φασματομετρία μάζας διπλής φάσης, χρησιμοποιώντας φασματόμετρο Q Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap. Για την ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση των πεπτιδίων/πρωτεϊνών εφαρμόστηκε το λογισμικό DIA-NN. Το λογισμικό Perseus (Έκδοση 1.6.15.0) χρησιμοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση και οπτικοποίηση δεδομένων. Πραγματοποιήθηκαν two samples t-tests για τη σύγκριση των ομάδων ARC-DC και ARC-PVC, ενώ τα αποτελέσματα οπτικοποιήθηκαν με volcano plots. Για τις συγκρίσεις μεταξύ όλων των ομάδων διενεργήθηκε έλεγχος με ANOVA και τα αποτελέσματα παρουσιάστηκαν σε heatmaps. Για το gene enrichment analysis χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό ShinyGO (Έκδοση 0.77). Όλες οι αναλύσεις των δημογραφικών δεδομένων πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της γλώσσας προγραμματισμού R και του IDE RStudio. Αποτελέσματα: Δημιουργήθηκε ένας πλούσιος άτλαντας του πρωτεϊνώματος του φακού, συμπεριλαμβανομένου του προσθίου περιφακίου, και του υδατοειδούς υγρού. Στην παρούσα μελέτη, εντοπίστηκαν συνολικά 1639 πρωτεΐνες στα δείγματα του υδατοειδούς υγρού, 2815 πρωτεΐνες στα δείγματα του πρόσθιου περιφακίου και 2975 πρωτεΐνες στο περιεχόμενο της κασέτας φακοθρυψίας. Η βιοσύνθεση γλυκοζαμινογλυκανών και η μη-κανονική οδός σηματοδότησης του υποδοχέα Wnt παρουσίασαν σημαντικά διαφορική έκφραση στην ομάδα γεροντικού καταρράκτη (ARC) σε σύγκριση με τις ομάδες διαβητικού καταρράκτη (DC) και καταρράκτη μετά από υαλοειδεκτομή (PVC). Στην ομάδα PVC, η ενεργοποίηση του συμπληρώματος παρουσίασε σημαντικά διαφορική έκφραση στα δείγματα υδατοειδούς υγρού, ενώ ο μεταβολισμός της γλουταθειόνης και η οξειδοαναγωγική δραστηριότητα παρουσίασαν σημαντικά διαφορική έκφραση στα δείγματα του πρόσθιου περιφακίου. Η κινητική δραστηριότητα μικροϊνιδίων, η οργάνωση του κυτταροσκελετού των μικροσωληνίσκων και η δέσμευση των μικροσωληνίσκων παρουσίασαν σημαντικά διαφορική έκφραση στις ομάδες DC και PVC τόσο στα δείγματα υδατοειδούς υγρού όσο και στα δείγματα του πρόσθιου περιφακίου. Στα δείγματα κασέτας φακοθρυψίας, οι πρωτεΐνες με σημαντικά διαφοροποιημένη έκφραση στην ομάδα ARC σε σύγκριση με τις ομάδες DC και PVC εμπλέκονταν σε μονοπάτια, όπως η δέσμευση ακτίνης, η αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης, η αποκατάσταση των νημάτων ακτίνης, η οργάνωση του φλοιώδους κυτταροσκελετού της ακτίνης και τα μονοπάτια μεταγωγής σήματος μέσω μικρών GTPασών. Στα δείγματα του περιεχομένου της κασέτας φακοθρυψίας, τα μονοπάτια με σημαντικά διαφορική έκφραση στην ομάδα ARC σε σύγκριση με τις ομάδες DC και PVC περιλάμβαναν τις μεταβολικές οδούς γλυκολιπιδίων, τη βιοσύνθεση γλυκοσφιγγολιπιδίων και τις μεταβολικές διαδικασίες γλυκοσφιγγολιπιδίων, με την GLA (α-γαλακτοσιδάση Α) να είναι μία από τις πιο σημαντικές πρωτεΐνες στην ομάδα ARC. Ομοίως, στα δείγματα πρόσθιου περιφακίου, τα κύρια μονοπάτια με σημαντικά διαφορική έκφραση στην ομάδα ARC σε σύγκριση με τις ομάδες DC και PVC ήταν οι μεταβολικές οδοί γλυκολιπιδίων, η βιοσύνθεση γλυκοσφιγγολιπιδίων και οι μεταβολικές διαδικασίες γλυκοσφιγγολιπιδίων, με την ST3GAL5 να είναι μία από τις πιο σημαντικές πρωτεΐνες στην ομάδα ARC. Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης διευρύνουν τις υπάρχουσες γνώσεις σχετικά με τις οδούς που εμπλέκονται στην παθοφυσιολογία του καταρράκτη. Στη συγκεκριμένη μελέτη, εντοπίστηκαν βασικές οδοί που εμπλέκονται στη δημιουργία γεροντικού καταρράκτη, διαβητικού καταρράκτη και καταρράκτη μετά από υαλοειδεκτομή. Η διαφορική έκφραση της μη-κανονικής οδού σηματοδότησης του υποδοχέα Wnt στον ARC μπορεί να προάγει την ανώμαλη πολλαπλασιαστική δραστηριότητα και μετανάστευση των επιθηλιακών κυττάρων του φακού, συμβάλλοντας έτσι στη δημιουργία καταρράκτη. Παρομοίως, η διαφορική έκφραση των οδών γλυκοζαμινογλυκανών και γλυκοσφιγγολιπιδίων στον γεροντικό καταρράκτη υποδηλώνει ενδεχόμενους θεραπευτικούς στόχους για την πρόληψη του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την επιδιόρθωση του κατεστραμμένου φακού. Στην ομάδα PVC, η σημαντικά διαφορική έκφραση των οξειδοαναγωγικών οδών στα δείγματα του πρόσθιου περιφακίου υποδηλώνει προστατευτικό ρόλο των επιθηλιακών κυττάρων του φακού έναντι του οξειδωτικού στρες. Ωστόσο, ο σχηματισμός καταρράκτη μετά από υαλοειδεκτομή μπορεί να προκύψει όταν το οξειδωτικό στρες υπερβεί τους προστατευτικούς μηχανισμούς. Αυτή είναι η πρώτη μελέτη που χρησιμοποιεί δείγματα από το περιεχόμενο της κασέτας φακοθρυψίας για τη διερεύνηση της παθοφυσιολογίας καταρράκτη, ανοίγοντας νέες προοπτικές για έρευνα. Τα αποτελέσματά μας αναδεικνύουν νέες οδούς που εμπλέκονται στην παθοφυσιολογία του καταρράκτη και προτείνουν θεραπευτικούς στόχους για την επιβράδυνση ή την πρόληψη της εξέλιξης του καταρράκτη. Μελλοντικές ερευνητικές κατευθύνσεις μπορούν να επικεντρωθούν στον εντοπισμό διαγνωστικών βιοδεικτών και την ανάπτυξη ενός συστήματος βαθμολόγησης για τη σοβαρότητα του καταρράκτη.