Pathogenetic mechanisms and cell subpopulations in the inflammatory response of systemic vasculitides

Abstract

Introduction: Giant cell arteritis (GCA) and Polymyalgia Rheumatica (PMR) are autoimmune/autoinflammatory disorders presenting as acute inflammatory responses that are highly responsive to steroids. GCA is an autoimmune disease affecting large vessels in patients over 50 years old. It is an exemplary model of a classic inflammatory disorder with IL-6 playing the leading role. The main comorbidities that may appear acutely or chronically are vascular occlusion leading to blindness and thoracic aorta aneurysm formation, respectively. The tissue inflammatory bulk is expressed as acute or chronic delayed-type hypersensitivity reactions, the latter being apparent by giant cell formation. The activated monocytes/macrophages are associated with pronounced Th1 and Th17 responses. B-cells and neutrophils also participate in the inflammatory lesion. However, the exact order of appearance and mechanistic interactions between cells are hindered by the lack of cellular and molecular information from early disease stages and accurate experimental models. Furthermore, clinical unmet needs include the lack of biomarkers associated with the assessment of disease activity and response to treatment, while patients may still experience disease relapse or adverse disease comorbidities (i.e., aneurysm formation) even after modern treatments such as biologic agents (i.e., tocilizumab, mavrilimumab) indicating that current targeted treatments may fail to control disease progression. Objectives: The current thesis aims to: A. To explore the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) in inflamed temporal artery biopsies (TABs) of patients with GCA. B. To identify novel soluble serum biomarkers in PET/CT-positive patients with LV-GCA and associate them with active (0 months) and inactive disease (6 months following treatment), in sequential serum samples, and C. To decipher the immune landscape including immune cell subpopulations, plasma cytokines, and small lipid mediators (LMs) at the very early stages of steroid treatment initiation in 4 distinct time points at: 0h (T1), 48h (T2), 96h (T3), and 24 weeks (T4).Patients and Methods: A. Ten patients with GCA [five with limited and five with associated generalized vascular involvement, as defined by 18F-fluorodeoxyglucose PET with CT (PET/CT)] and eight with PMR were studied. The presence, location, quantitation, and decoration of NETs with IL-6, IL-1b, and IL-17A were assessed in TABs at the time of disease diagnosis by tissue immunofluorescence and confocal microscopy. Paired serum levels of IL-6 and IL-17A were also evaluated in all patients. B. 18F-fluorodeoxyglucose positron emission tomography-computed tomography (18F-FDG PET-CT) is among the imaging techniques contributing to the diagnosis of patients with systemic disease. The PET/CT derived metric, Most-Disease-Segment Target-to-Background Ratio (TBRMDS), was calculated for 13 LV-GCA patients, while 14 cranial-GCA and 14 Polymyalgia Rheumatica patients with negative initial PET/CT served as disease controls. Serum macrophage-related cytokines were evaluated by Cytometric Bead Array (CBA). Finally, previously published NMR-metabolomics data acquired from the same blood sampling were analyzed along with PET/CT findings. C. Serum, plasma, and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were collected prospectively from 8 GCA and 6 PMR newly diagnosed patients. Sixteen healthy individuals served as controls (HC). Deep immunophenotyping by CyTOF was performed in PBMCs at T1-T3. A multiplexed Luminex assay measured serum levels of 21 cytokines at T1 and T3. Lipid mediators (LMs) levels were evaluated at T1, T3, and T4 with the LC-MS/MS method. Results: A. NETs were detected in all TABs from GCA, but not PMR, patients that located mainly in the adventitia, adjacent to the vasa vasorum. NETs decorated with IL-6 were present in 8/10 TABs of GCA patients, of whom 5 were PET/CT(+) and 3 were PET/CT(–) patients. IL-17A(+) NETs were observed in all GCA patients. IL-1b(+) NETs were not detected in any GCA patient. No relation was found between serum IL-6 and IL-17A levels and NETs containing IL-6 and/or IL-17A.B. TBRMDS was significantly increased in active versus inactive disease (3.32 vs. 2.65, p = 0.006). The analysis identified 9 serum metabolites, as more sensitive to change from the active to inactive disease states. Among them, choline levels were exclusively altered in the LV-GCA group, but not in the disease control group. Cytokine levels were not associated with PET/CT activity. Combining CRP, ESR, and TBRMDS with choline levels, a composite index was generated to distinguish active and inactive LV-GCA (20.4 vs 11.62, p=0.001).C. Total CD8+ T cells and DCs were decreased within 48-96 hours, following steroid treatment, while B-cells were increased at 48 hours. Further analysis of immune subpopulations containing the major cell types revealed different frequencies of distinct CD8+, CD4+, DCs, and B cell subtypes. Out of 21 cytokines/chemokines evaluated, only ITAC levels were decreased at T3. The ratio of pro/anti-inflammatory LMs was high at T1 in patients with either PMR or GCA. However, 6 months after steroid treatment it returned to normal in PMR patients, but remained high in GCA patients, providing the only discriminatory element between the two diseases. Conclusions: A. NETs bearing pro-inflammatory cytokines are present in inflamed GCA-TABs. Future studies with a larger number of patients from different centers will show whether the findings regarding neutrophils/NETs in the TAB are consistent and disclose their clinical impact. B. The preliminary results of the current thesis on serum biomarkers associated with clinical data could pave the way for more extensive studies integrating serum metabolomic parameters with PET/CT imaging data to extract sensitive composite disease indexes useful for everyday clinical practice. C. The rapid clinical improvement of GCA and PMR patients following steroid treatment, is associated with immune cell type alterations, but it is poorly associated with plasma cytokine levels. Small lipid mediators can differentiate GCA and PMR patients. The persistently elevated levels of pro-inflammatory LMs might be related to the underlying residual tissue inflammation described in GCA. These preliminary results suggest that further studies in a larger patient cohort are required to validate these findings and identify new therapeutic targets and/or disease-specific biomarkers.

Εισαγωγή: Η Γιγαντοκυτταρική Αγγειίτιδα (ΓΑ) και η Ρευματική Πολυμυαλγία (ΡΠ) είναι αυτοάνοσα/αυτοφλεγμονώδη νοσήματα που εκδηλώνονται ως οξείες φλεγμονώδεις αντιδράσεις οι οποίες ανταποκρίνονται εξαιρετικά σε στεροειδή. Η ΓΑ είναι μια αυτοάνοση ασθένεια που προσβάλλει τα μεγάλα αγγεία ασθενών άνω των 50 ετών. Αποτελεί πρότυπο κλασικής φλεγμονώδους διαταραχής, με την IL-6 να κατέχει κύριο ρόλο στην παθοφυσιολογία της νόσου. Οι κύριες συννοσηρότητες που μπορεί να εμφανιστούν οξείως ή χρόνια είναι η αγγειακή απόφραξη που μπορεί να οδηγήσει σε τύφλωση και τη δημιουργία ανευρύσματος στην θωρακική αορτή, αντίστοιχα. Η φλεγμονώδης διαδικασία εκφράζεται ως οξεία ή χρόνια αντίδραση επιβραδυνόμενης υπερευαισθησίας (τύπου 4), με τη δεύτερη να είναι εμφανής από τον σχηματισμό γιγαντoκυττάρων. Τα ενεργοποιημένα μονοκύτταρα/μακροφάγα συνδέονται με έντονες απαντήσεις των Th1 και Th17 βοηθητικών κυττάρων. Τα Β-κύτταρα και τα ουδετερόφιλα συμμετέχουν επίσης στη φλεγμονώδη βλάβη. Ωστόσο, η ακριβής σειρά εμφάνισης και οι μηχανιστικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κυττάρων δεν είναι πλήρως κατανοητές λόγω της έλλειψης κυτταρικών και μοριακών πληροφοριών από τα πρώιμα στάδια της ασθένειας αλλά και της έλλειψης κατάλληλων πειραματικών μοντέλων. Επιπλέον, οι κλινικές ανεκπλήρωτες ανάγκες περιλαμβάνουν την έλλειψη βιοδεικτών που σχετίζονται με την εκτίμηση της ενεργότητας της νόσου και της ανταπόκρισης στη θεραπεία, ενώ οι ασθενείς ενδέχεται να εμφανίσουν υποτροπή της νόσου ή δυσμενείς συννοσηρότητες της νόσου (δημιουργία ανευρύσματος), ακόμη και μετά από σύγχρονες θεραπείες όπως οι βιολογικοί παράγοντες (tocilizumab, mavrilimumab), υποδεικνύοντας ότι οι υπάρχουσες στοχευμένες θεραπείες ενδέχεται να αποτύχουν στην αποτροπή της προόδου της νόσου. Στόχοι: Οι στόχοι της διδακτορικής διατριβής είναι: Α. Να εξετάσει την παρουσία εξωκυττάριων παγίδων χρωματίνης των ουδετερόφιλων (NETs) σε βιοψίες κροταφικών αρτηριών (TABs) ασθενών με ΓΑ. Β. Να εντοπίσει νέους διαλυτούς βιοδείκτες ορού σε ασθενείς με Αγγειίτιδα Μεγάλων Αγγείων (LV-GCA) και θετική εξέταση PET/CT μεγάλων αγγείων και να τους συσχετίσει με την ενεργό (0 μήνες) και ανενεργό φάση της νόσου (6 μήνες μετά την θεραπεία), σε διαδοχικά δείγματα ορού. Γ. Να χαρακτηρίσει το ανοσολογικό προφίλ, συμπεριλαμβανομένων των υποπληθυσμών ανοσοκυττάρων, των κυτταροκινών του πλάσματος και των μικρών λιπιδικών διαμεσολαβητών (LMs), στις πολύ πρώιμες φάσεις της έναρξης θεραπείας με στεροειδή σε 4 διακριτά χρονικά σημεία: 0 ώρες (T1), 48 ώρες (T2), 96 ώρες (T3) και 24 εβδομάδες (T4). Ασθενείς και Μέθοδοι: A. Δέκα ασθενείς με ΓΑ [5 με περιορισμένη και 5 με γενικευμένη αγγειακή συμμετοχή, όπως καθορίστηκε από την διενέργεια 18F-FDG PET/CT] και 8 με ΡΠ συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. Η παρουσία, η τοποθεσία, η ποσοτικοποίηση και η διακόσμηση των NETs με IL-6, IL-1β και IL-17A προσδιορίστηλαν σε TABs που λήφθηκαν κατά τη διάγνωση της νόσου μέσω ανοσοφθορισμού σε ιστό και συνεστιακής μικροσκοπίας. Τα επίπεδα IL-6 και IL-17A στον ορό υπολογίστηκαν επίσης για όλους τους ασθενείς. B. Η 18F-FDG PET/CT είναι μία από τις απεικονιστικές τεχνικές που συμβάλλουν στη διάγνωση ασθενών με συστηματική νόσο. Ο δείκτης Most-Disease-Segment Target-to-Background Ratio (TBRMDS) που εξάγεται από την εξέταση PET/CT, υπολογίστηκε για 13 ασθενείς με Αγγειίτιδα Μεγάλων Αγγείων (LV-GCA), ενώ 14 ασθενείς με κροταφική ΓΑ και 14 ασθενείς με ΡΠ με αρνητική απεικόνιση PET/CT χρησίμευσαν ως ομάδες ελέγχου. Τα επίπεδα των κυτταροκινών που σχετίζονται με τα μακροφάγα υπολογίστηκαν στον ορό μέσω Cytometric Bead Array (CBA). Τέλος, αναλύθηκαν τα δεδομένα NMR-μεταβολωμικής ανάλυσης που είχαν αποκτηθεί από το ίδιο δείγμα αίματος μαζί με τα απεικονιστικά ευρήματα του PET/CT.Γ. Ορός και πλάσμα περιφερικού αίματος, καθώς και μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) συλλέχθηκαν προοπτικά από 8 ασθενείς με ΓΑ και 6 ασθενείς με ΡΠ κατά την διάγνωση. Δεκαέξι υγιείς άνθρωποι χρησίμευσαν ως ομάδα ελέγχου (HC). Η εν τω βάθη ανοσοφαινοτύπηση με CyTOF πραγματοποιήθηκε στα PBMCs στα χρονικά σημεία T1-T3. Μια ανοσοδοκιμασία τύπου Luminex χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των επιπέδων 21 κυτταροκινών στον ορό στα χρονικά σημεία T1 και T3. Τα επίπεδα των μικρών λιπιδικών διαμεσολαβητών (LMs) αξιολογήθηκαν στα χρονικά σημεία T1, T3 και T4 με τη μέθοδο LC-MS/MS. Αποτελέσματα: A. Τα NETs ανιχνεύθηκαν σε όλες τις βιοψίες των ασθενών με ΓΑ, αλλά όχι στις βιοψίες ασθενών με ΡΠ, και εντοπίστηκαν κυρίως στην περιοχή του έξω χιτώνα, πλησίον των μικρών αγγείων που τροφοδοτούν το αγγειακό τοίχωμα. NETs διακοσμημένα με IL-6 βρέθηκαν σε 8/10 TABs των ασθενών με ΓΑ, από τους οποίους οι 5 ήταν θετικοί και οι 3 αρνητικοί στην απεικόνιση PET/CT μεγάλων αγγείων. Τα NETs που φέρουν IL-17A εντοπίστηκαν σε όλους τους ασθενείς με ΓΑ. Δεν ανιχνεύθηκαν σε ασθενείς με ΓΑ NETs διακοσμημένα με IL-1β. Δεν βρέθηκε συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων IL-6 και IL-17A στον ορό και των NETs που περιείχαν IL-6 και/ή IL-17A.B. Ο δείκτης TBRMDS ήταν σημαντικά αυξημένος στην ενεργό σε σχέση με την ανενεργό φάση της νόσου (3,32 έναντι 2,65, p = 0,006). Η ανάλυση εντόπισε 9 μεταβολίτες ορού, οι οποίοι μεταβάλλονταν στατιστικά σημαντικά από την ενεργό στην ανενεργό φάση της νόσου. Από αυτούς, τα επίπεδα χολίνης μεταβάλλονταν αποκλειστικά στην ομάδα των ασθενών με Αγγειίτιδα Μεγάλων Αγγείων (LV-GCA), αλλά όχι στις ομάδες ελέγχου της νόσου. Τα επίπεδα κυτταροκινών δεν συσχετίστηκαν με την ενεργότητα της νόσου κατά την απεικόνιση με PET/CT. Συνδυάζοντας τις τιμές της C αντιδρώσας πρωτεΐνης (CRP), της ταχύτητας καθιζήσεως (ESR) και TBRMDS με τα επίπεδα χολίνης, δημιουργήθηκε ένας σύνθετος δείκτης για τη διάκριση της ενεργής και της ανενεργής νόσου Αγγειίτιδας Μεγάλων Αγγείων (LV-GCA) (20,4 έναντι 11,62, p=0,001). C. Ο συνολικός αριθμός των CD8+ T κυττάρων και δενδριτικών κυττάρων (DCs) μειώθηκε μέσα σε 48-96 ώρες μετά την θεραπεία με στεροειδή, ενώ τα Β-κύτταρα αυξήθηκαν στις 48 ώρες. Περαιτέρω ανάλυση των υποπληθυσμών ανοσοκυττάρων που συμπεριλαμβάνονται στους κύριους τύπους ανοσοκυττάρων έδειξε διαφορετικά ποσοστά διαφόρων ανοσοφαινοτύπων των CD8+, CD4+, DCs και Β κυττάρων. Από τις 21 κυτταροκίνες/χημοκίνες των οποίων τα επίπεδα υπολογίστηκαν, μόνο τα επίπεδα της χημοκίνης ITAC μειώθηκαν στο χρονικό σημείο T3. Ο λόγος των προ/αντιφλεγμονωδών LMs ήταν υψηλός στο χρονικό σημείο T1 σε ασθενείς με ΡΠ και ΓΑ. Ωστόσο, 6 μήνες μετά τη θεραπεία με στεροειδή, επέστρεψε σε φυσιολογικά επίπεδα στους ασθενείς με ΡΠ, αλλά παρέμεινε υψηλός στους ασθενείς με ΓΑ, προσφέροντας το μόνο διαλυτό στοιχείο του ορού ικανό να διακρίνει τις δύο νόσους. Συμπεράσματα: A. Τα NETs που φέρουν φλεγμονώδεις κυτταροκίνες εντοπίζονται στον φλεγμαίνοντα ιστό ασθενών με ΓΑ. Μελλοντικές μελέτες με μεγαλύτερο αριθμό ασθενών από πολλαπλά κέντρα θα δείξουν αν τα ευρήματα σχετικά με τα ουδετερόφιλα/NETs στις TAB είναι συνεπή και θα αποκαλύψουν τη κλινική τους συσχέτιση με τη νόσο. B. Τα προκαταρκτικά αποτελέσματα της παρούσας διατριβής σχετικά με τους βιοδείκτες ορού που σχετίζονται με τα απεικονιστικά δεδομένα θα μπορούσαν να ανοίξουν το δρόμο για εκτενέστερες μελέτες που θα ενσωματώνουν παραμέτρους μεταβολωμικής του ορού με δεδομένα απεικόνισης PET/CT για την εξαγωγή ευαίσθητων σύνθετων δεικτών νόσου χρήσιμων για την καθημερινή κλινική πρακτική. Γ. Η ταχεία κλινική βελτίωση των ασθενών με ΓΑ και ΡΠ μετά από θεραπεία με στεροειδή, σχετίζεται με αλλαγές στους ανοσολογικούς τύπους κυττάρων, αλλά είναι ασθενώς συνδεδεμένη με τα επίπεδα κυτταροκινών στον πλάσμα. Τα επίπεδα των μικρών λιπιδικών μεσολαβητών μπορούν να διαφοροποιήσουν τους ασθενείς με ΓΑ και ΡΠ. Τα αυξημένα επίπεδα των φλεγμονωδών LMs μπορεί να σχετίζονται με την υποκείμενη ιστική βλάβη και την υποκλινική φλεγμονή που περιγράφεται στη ΓΑ. Αυτά τα προκαταρκτικά αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι απαιτούνται περαιτέρω μελέτες σε μεγαλύτερη ομάδα ασθενών για την επικύρωση των ευρημάτων και τον εντοπισμό νέων θεραπευτικών στόχων ή/και ειδικών για τη νόσο βιοδεικτών.