Synthesis of tyrosinase inhibitors and probes for mechanistic studies

Abstract

The present thesis comprises two parts. In Chapter A, the synthesis, characterization and cellular assessment of new BODIPY dyes are reported, while Chapter B presents the synthesis and biological evaluation of potential tyrosinase inhibitors. BODIPY dyes represent a class of fluorophores exhibiting interesting properties with a great variety of applications including in the biomedical field. There is a wide research interest in BODIPY dyes especially in the synthesis of novel derivatives with improved optical properties. Towards this direction, we embarked on the design and synthesis of a library of fluorophores based on the BODIPY platform. Our aim was to perform a structure-properties relationship study in order to elucidate the factors that influence the photophysical properties of the newly synthesized dyes. Thus, we varied the substituent, the linker between the BODIPY core and the substituent, the position of the substituents and finally we combined different substituents connected at various positions. More specifically: a) we introduced various heteroaryl substituents at the C2 or C3 position of the BODIPY core and b) we extended the π conjugation system through derivatization at position(s) 3 and/or 5 and/or 6, mainly focusing on tuning the photophysical properties towards the red spectral window. Thus, starting from 1,3,5,7-tetramethyl-8-phenyl-4,4-difluoroboradiazaindacene (8-phenyl BODIPY), mono-, di- and tri-substituted BODIPY derivatives were synthesized. Among the heterocyclic groups introduced, the 1,3-benzothiazole ring (BZT) proved to be a moiety of great significance, chemically stable, that brought remarkable changes on the photophysical properties of the newly synthesized derivatives. Thus, alternative means of attachment of BTZ (directly or via a vinyl bridge at the 3 and/or 5 methyl groups) as well as in combination with other functional groups were used. In total, through simple chemical modifications, we developed 24 new BODIPY dyes that exhibited long absorption (from 492 to 670 nm) and emission (from 509 to 677 nm) wavelengths, moderate quantum yields (within the range 0.01-0.73) and suitable Stokes shifts (between 4 and 57 nm) with respect to that of the unsubstituted 8-phenyl BODIPY 8 (λabs=499 nm, λemi=508 nm, φ=0.60-0.78 in different solvents).Based on the photophysical properties of the new BODIPY analogs, eight among them were chosen for evaluation in cellular systems. More specifically, we performed a staining protocol in mouse fibroblasts to assess their cellular localization and efficiency. We found that six (6) of them efficiently stained the cell membrane at low concentrations (1 and 0.1 μM) and were non-toxic even after 24 h incubation. The new dyes presented intracellular localization, while exhibited different staining patterns. Among them, TC498 was reported as a new promising candidate that could be applied in co-staining protocols with dyes that are excited or emitting at 405, 488 or 633 nm. Furthermore, (TD)DFT calculations were carried out to corroborate the experimental findings through the calculation of the electron distribution across the BODIPY core. Moving to the second part of this work, it is well established that Tyrosinase plays a significant role in melanogenesis possessing dual activity, namely the o-hydroxylation of monophenols and the oxidation of o-diphenols to o-quinones. However, intrigued by the lack of effective tyrosinase inhibitors, we aimed to synthesize new compounds that could effectively suppress melanogenesis in the treatment of hyperpigmentation (skin whitening) and develop enzyme-directed anti-melanoma chemotherapy. Towards this direction, capitalizing on the encouraging results of previous unpublished work from the research group of Dr. Calogeropoulou, the first generation tyrosinase inhibitors included hybrids of 3-hydroxytyrosol (HT) and the natural product Methyl Taboganate (PT) joined together through different linkers (alkyl or triazole-containing chains). In the present work, we proceeded with the design and synthesis of 2nd generation tyrosinase inhibitors, in which the HT moiety was replaced by tropolone. Thus, two series of novel derivatives, potential tyrosinase inhibitors were synthesized. The first included tropolone-PT hybrids, in comparison to the HT-PT hybrids, connected via different linkers, while the second series contained tropolone derivatives bearing various substituents at the C5-position of the tropolone ring. The key reactions for the synthesis of both series of analogs were Heck and Sonogashira cross-coupling reactions or a click reaction. Preliminary assessment of the melanogenesis inhibitory activity of the new compounds was performed using zebrafish embryos and showcased TC583 and TC596 as the most potent among the two series. Furthermore the new analogs were tested in 3D spheroid models to evaluate their potential anticancer effects beyond pigmentation control. The scientific question posed was to determine whether the candidate tyrosinase inhibitors exert a broad-spectrum anticancer effect beyond melanin-associated cancers. The results suggest that TC593 and TC596, could be repurposed as anticancer agents—especially for glioblastoma multiforme—while devoiding depigmentation side effects. However, additional experiments are required to investigate fully the efficacy of these compounds.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποτελείται από 2 κεφάλαια. Στο Κεφάλαιο A, αναφέρονται η σύνθεση, ο χαρακτηρισμός και η κυτταρική αξιολόγηση νέων χρωστικών BODIPY, ενώ στο Κεφάλαιο B παρουσιάζεται η σύνθεση και η βιολογική αξιολόγηση πιθανών αναστολέων της τυροσινάσης. Οι χρωστικές BODIPY αποτελούν μία κατηγορία φθοριζόντων μορίων, που παρουσιάζουν ενδιαφέρουσες ιδιότητες με μία μεγάλη ποικιλία εφαρμογών, περιλαμβανομένων αυτών στον τομέα της Βιοϊατρικής. Υπάρχει ιδιαίτερο ερευνητικό ενδιαφέρον για τις χρωστικές BODIPY και ειδικότερα τη σύνθεση καινοτόμων ενώσεων με βελτιωμένες οπτικές ιδιότητες. Προς αυτή την κατεύθυνση, στραφήκαμε στο σχεδιασμό και τη σύνθεση μίας βιβλιοθήκης φθοροφόρων ενώσεων με βάση τη δομή του BODIPY. Στόχος μας ήταν να πραγματοποιήσουμε μία μελέτη συσχέτισης δομής-ιδιοτήτων, με σκοπό να ερευνήσουμε τους παράγοντες που επηρεάζουν τις φωτοφυσικές ιδιότητες των νεοσυντιθέμενων χρωστικών. Γι’ αυτό τον λόγο, χρησιμοποιήσαμε διαφορετικούς υποκαταστάτες, διαφορετικό συνδέτη μεταξύ του πυρήνα του BODIPY και των υποκαταστατών, διαφορετική θέση των υποκαταστατών, ενώ τελικά συνδυάσαμε διαφορετικούς υποκαταστάτες σε διάφορες θέσεις. Ειδικότερα: α) εισάγαμε διάφορους ετεροκυκλικούς υποκαταστάτες στις θέσεις C2 ή C3 του BODIPY και β) επεκτείναμε το π συζευγμένο σύστημα μέσω της παραγοντοποίησης των θέσεων 3 και/ή 5 και/ή 6, εστιάζοντας κυρίως στον συντονισμό των φωτοφυσικών ιδιοτήτων προς την κόκκινη περιοχή του φάσματος ορατού φωτός. Στο πλαίσιο αυτό, ξεκινώντας από το 1,3,5,7-tetramethyl-8-phenyl-4,4-difluoroboradiazaindacene (8-phenyl BODIPY), συντέθηκαν μονο-, δι- και τρι-υποκαταστημένα ανάλογα BODIPY. Ανάμεσα στις ετεροκυκλικές ομάδες που εισήχθησαν, ο δακτύλιος 1,3-benzothiazole (BZT) αναδείχθηκε ως ιδιαίτερα σημαντικός και χημικά σταθερός υποκαταστάτης, επιφέροντας αξιοσημείωτες αλλαγές στις φωτοφυσικές ιδιότητες των νεοσυντιθέμενων παραγώγων. Γι’ αυτό το λόγο, χρησιμοποιήθηκαν εναλλακτικά μέσα προσάρτησης του BTZ (άμεσα ή μέσω βινυλικής γέφυρας στα μεθύλια 3 και/ή 5) καθώς και σε συνδυασμό με άλλες λειτουργικές ομάδες.Συνολικά, μέσω απλών χημικών τροποποιήσεων, συνθέσαμε 24 νέες χρωστικές BODIPY εμφανίζοντας απορρόφηση (από 492 έως 670 nm) και εκπομπή (από 509 έως 677 nm) σε υψηλότερα μήκη κύματος, ενδιάμεσες τιμές κβαντικών αποδόσεων ( 0.01-0.73) και κατάλληλες Stokes shifts (μεταξύ 4 και 57 nm) συγκριτικά με το μη υποκατεστημένο αρχικό μόριο αναφοράς 8-phenyl BODIPY 8 (λabs=499 nm, λemi=508 nm, φ=0.60-0.78 σε διαφορετικούς διαλύτες). Βασιζόμενοι στις φυσικές ιδιότητες των νέων αναλόγων BODIPY, 8 από αυτά επιλέχθηκαν για αξιολόγηση σε κυτταρικά συστήματα. Ειδικότερα, εφαρμόστηκε πρωτόκολλο χρώσης σε ινοβλάστες ποντικών ώστε να εκτιμηθεί ο κυτταρικός εντοπισμός και η αποτελεσματικότητά τους. Βρέθηκε ότι 6 από αυτές τις χρωστικές χρωματίζουν αποτελεσματικά την κυτταρική μεμβράνη σε χαμηλές συγκεντρώσεις (1 και 0.1 μM) και ήταν μη τοξικές ακόμα και μετά από 24 ώρες επώασης. Οι νέες χρωστικές παρουσίασαν ενδοκυτταρικό εντοπισμό, ενώ εμφάνισαν διαφορετικά μοτίβα χρώσης. Μεταξύ αυτών, η ένωση TC498 αναδείχθηκε ως μία υποψήφια χρωστική που θα μπορούσε να αξιοποιηθεί σε πρωτόκολλα συν-χρώσης με άλλες χρωστικές που διεγείρονται ή εκπέμπουν σε μήκη κύματος 405, 488 ή 633 nm. Επιπλέον, (TD)DFT υπολογισμοί διενεργήθηκαν ώστε να υποστηρίξουν περαιτέρω τα πειραματικά ευρήματα μέσω του υπολογισμού κατανομής των ηλεκτρονίων κατά μήκος της δομής του BODIPY. Προχωρώντας στο δεύτερο κεφάλαιο της παρούσας εργασίας, είναι αποδεδειγμένο ότι η τυροσινάση διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην μελανογένεση κατέχοντας διττό ρόλο, και συγκεκριμένα την o-υδροξυλίωση των μονοφαινολών και την οξείδωση των o-διφαινολών σε o-κινόνες. Ωστόσο, λαμβάνοντας υπόψιν την έλλειψη αποτελεσματικών αναστολέων της τυροσινάσης, σκοπός μας ήταν να συνθέσουμε νέες ενώσεις, οι οποίες θα μπορέσουν αποτελεσματικά να καταστείλουν την μελανογένεση στη θεραπεία της υπερμελάγχρωσης (λεύκανση δέρματος) και να αναπτύξουμε χημειοθεραπεία ελεγχόμενη από το ένζυμο κατά του μελανώματος. Προς αυτή την κατεύθυνση, ξεκινώντας από τα ενθαρρυντικά αποτελέσματα προηγούμενης μη δημοσιευμένης εργασίας από την ερευνητική ομάδα της Δρ. Καλογεροπούλου, η πρώτη γενιά αναστολέων της τυροσινάσης αποτελούσαν υβριδικές ενώσεις της 3-υδροξυτυροσόλης (HT) και του φυσικού προϊόντος Methyl Taboganate (PT) ενωμένα με διάφορους συνδέτες (αλκυλο- ή τριαζόλια-περιεχόμενες αλυσίδες). Στην παρούσα εργασία, προχωρήσαμε στο σχεδιασμό και τη σύνθεση 2ης γενιάς αναστολέων της τυροσινάσης, στους οποίους η HT αντικαταστάθηκε από την τροπολόνη. Ως εκ τούτου, συντέθηκαν δύο σειρές νέων ενώσεων, πιθανών αναστολέων της τυροσινάσης. Η πρώτη σειρά περιελάμβανε υβριδικές ενώσεις τροπολόνης-PT, σε σύγκριση με τις υβριδικές ενώσεις HT-PT, συζευγμένα μέσω διαφορετικών συνδετών, ενώ η δεύτερη σειρά περιελάμβανε ανάλογα της τροπολόνης φέροντας διαφορετικούς υποκαταστάτες στην θέση C5 του δακτυλίου της τροπολόνης. Οι αντιδράσεις-κλειδιά για τη σύνθεση των δύο σειρών αναλόγων ήταν οι αντιδράσεις διασταυρούμενης σύζευξης Heck και Sonogashira ή η αντίδραση click. Προκαταρκτική αξιολόγηση της ανασταλτικής δράσης ως προς την μελανογένεση των νέων ενώσεων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας zebrafish embryos και κατέδειξε τις ενώσεις TC583 και TC596 ως τα πιο δραστικές και από τις δύο σειρές ενώσεων. Επιπλέον τα νέα ανάλογα ελέγχθηκαν σε μοντέλο 3D spheroid ώστε να εκτιμηθούν οι πιθανές αντικαρκινικές δράσεις τους πέρα από τον έλεγχο της μελάγχρωσης. Το επιστημονικό ερώτημα που τέθηκε ήταν να καθοριστεί εάν οι υποψήφιοι αναστολείς της τυροσινάσης εμφανίζουν ευρέος φάσματος αντικαρκινική δράση εκτός από καρκίνους που σχετίζονται με την μελανίνη. Τα αποτελέσματα προτείνουν ότι οι ενώσεις TC593 και TC596, θα μπορούσαν να επαναπροσδιοριστούν ως αντικαρκινικοί παράγοντες—ειδικότερα για το πολύμορφο γλοιοβλάστωμα— χωρίς παρενέργειες αποχρωματισμού. Ωστόσο, επιπρόσθετα πειράματα απαιτούνται ώστε να ερευνηθεί πλήρως η αποτελεσματικότητα αυτών των ενώσεων.