Σύνθεση νέων ετεροκυκλικών αναλόγων με πιθανή αντιπαρασιτική δράση

Abstract

According to the World Health Organization (WHO), millions of people die every year from neglected tropical diseases such as Human African Trypanosomiasis (HAT) and Leishmaniasis. The available treatments for these diseases present significant challenges, including severe side effects, the need for prolonged and costly therapy, and the emergence of parasite resistance. iltefosine (Hexadecylphosphocholine) was the first orally administered drug for the treatment of visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). However, it is associated with serious side effects, a low therapeutic index, and a long half life, which underscores the need for the development of new treatments with greater efficacy and lower toxicity against neglected diseases. To address the adverse effects of miltefosine, the aim of this doctoral dissertation was the design and synthesis of new antiparasitic compounds, expanding the chemical diversity of potential drugs for neglected diseases. Specifically, 40 new alkylphosphocholine analogues were synthesized, in which the phosphate group was bioisosterically replaced by a 4-thiazolidinone ring.The biological evaluation was conducted by the research group of Professor Anabela Cordeiro-da-Silva at the Institute of Molecular and Cell Biology of the Institute for Research and Innovation of the University of Porto (i3S). The biological studies confirmed the antiparasitic activity of the new analogues. Some of these analogues exhibited activity against T. brucei, the etiological agent of HAT, while others were effective against the amastigote form of L. infantum, the parasite responsible for human leishmaniasis. Certain analogues demonstrated efficacy against both parasites. Further studies on one of the new compounds against different Leishmania strains revealed equally satisfactory activity across all strains while miltefosine’s efficacy varies depending on the parasite species. Additionally, the evaluation of two analogues against miltefosine-resistant L. infantum strains yielded highly encouraging results. These findings suggest that the bioisosteric substitution of the phosphate group in alkylphosphocholines with a 4-thiazolidinone group is a promising strategy for the design of new potent and selective drugs for the treatment of parasitic diseases. Additionally, in vitro ADME-Tox studies of selected analogues were performed to assess their interactions with cytochrome P450 enzymes by the group of Dr Theodora Katsila at the Institute of Chemical Biology of the National Hellenic Research Foundation. Specifically, the metabolic stability in human liver microsomes and the metabolism via CYP450 enzymes were investigated for selected 4-thiazolidinone analogues that exhibited strong antileishmanial and/or antitrypanosomal activity with low toxicity. All analogues showed slow or moderate degradation at t = 60 minutes. Furthermore, all analogues were found to be weak or moderate inhibitors of the CYP450 enzyme system, except for one analogue, which proved to be a strong inhibitor of CYP2A6, suggesting that potential drug interaction with CYP2A6 may arise. Finally, the results of the pharmacokinetic analysis using the Snapshot PK method provided information on the absorption, distribution, and clearance of selected compounds. These data led to further investigation of their antileishmanial activity in female BALB/c mice infected with L. infantum amastigotes expressing luciferase administered orally 20mg/Kg/day for 10 days. However, the selected molecules did not exhibit significant antiparasitic activity in the BALB/c model. Given that the compounds tested had a favorable snapshot pharmacokinetic profile and microsomal stability, the absence of antiparasitic activity in vivo may be due to poor targeting to specific organs or unexpected changes in the properties of the molecule. Leishmania infection has a specific tropism to target organs and bioaccumulation in them is important for parasite clearance. Further studies are needed to understand the lack of antileishmanial activity in vivo, but a possible explanation is that the compounds, despite being bioavailable in the blood, are not properly distributed to target organs such as the spleen, liver, and bone marrow. Indeed, formulating the compounds in a suitable pharmaceutical form could allow them to reach the target organs and at the same time enhance their activity in vivo.

Σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (ΠΟΥ), εκατομμύρια άνθρωποι πεθαίνουν κάθε χρόνο από τις "παραμελημένες" τροπικές νόσους, όπως η Aφρικανική Τρυπανοσωμίαση (Human African Trypanosomiasis, ΗΑΤ), και η Λεϊσμανίαση. Τα υπάρχοντα φάρμακα για την αντιμετώπιση αυτών των ασθενειών χαρακτηρίζονται από σημαντικά προβλήματα, όπως οι σοβαρές παρενέργειες, η μακροχρόνια και δαπανηρή θεραπεία και η ανάπτυξη ανθεκτικότητας στα παράσιτα. Η μιλτεφοσίνη (εξαδεκυλοφωσφοχολίνη), αποτέλεσε το πρώτο χορηγούμενο από το στόμα φάρμακο για τη θεραπεία της σπλαχνικής (VL) και της δερματικής λεϊσμανίασης (CL), ωστόσο συνοδεύεται από σοβαρές παρενέργειες, χαμηλό θεραπευτικό δείκτη και μεγάλο χρόνο ημιζωής, γεγονός που οδηγεί στην αναζήτηση νέων φαρμάκων με ισχυρότερη δράση και μικρότερη τοξικότητα. Με στόχο την αντιμετώπιση των παρενεργειών της μιλτεφοσίνης, σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν ο σχεδιασμός και η σύνθεση νέων αντιπαρασιτικών ενώσεων με σκοπό την διεύρυνση της χημικής ποικιλομορφίας των νέων φαρμάκων για τις παραμελημένες ασθένειες. Συγκεκριμένα συντέθηκαν 40 νέα ανάλογα αλκυλοφωσφοχολινών στα οποία η φωσφορική ομάδα έχει αντικατασταθεί από τον βιοϊσοστερή δακτύλιο της 4-θειαζολιδινόνης. Η βιολογική αποτίμηση πραγματοποιήθηκε από την ερευνητική ομάδα της καθηγήτριας Anabela Cordeiro-da-Silva στο Ινστιτούτο Μοριακής και Κυτταρικής Βιολογίας του Ινστιτούτου Ερευνών και Καινοτομίας του Πανεπιστημίου του Πόρτο i3S. Τα αποτελέσματα των βιολογικών μελετών απέδειξαν την αντιπαρασιτική δράση των νέων 4-θειαζολιδινονικών αναλόγων. Συγκεκριμένα ορισμένα από αυτά έδειξαν δράση έναντι του αιτιολογικού παράγοντα της HAT, Trypanosoma brucei, ενώ άλλα παρουσίασαν αποτελεσματικότητα κατά της προμαστιγωτής και της αμαστιγωτής μορφής της Leishmania Infantum, που ευθύνεται για την εκδήλωση της λεϊσμανίασης στον άνθρωπο. Κάποια από τα ανάλογα εμφάνισαν πολύ καλή δράση έναντι και των δύο παρασίτων. Επίσης πραγματοποιήθηκαν μελέτες σε ένα από τα δραστικά μόρια, έναντι διαφόρων στελεχών της Leishmania και έδειξαν ισοδύναμα ικανοποιητική δράση σε όλα τα στελέχη. Αντιθέτως η μιλτεφοσίνη παρουσιάζει διακυμάνσεις στην δραστικότητά της ανάλογα με το είδος του παρασίτου. Ακόμα, αξιολόγηση δύο αναλόγων κατά των ανθεκτικών στην μιλτεφοσίνη στελεχών L. infantum έδωσε πολύ ενθαρρυντικά αποτελέσματα. Οι πρώτες ενδείξεις δείχνουν ότι η βιοϊσοστερική αντικατάσταση της φωσφορικής ομάδας στις αλκυλοφωσφοχολίνες με την 4-θειαζολιδινόνη αποτελεί μια εύστοχη στρατηγική προς τον σχεδιασμό νέων δραστικών και εκλεκτικών φαρμάκων για την αντιμετώπιση των παρασιτικών ασθενειών. Επιπλέον πραγματοποιήθηκαν in vitro ADME-Tox μελέτες επιλεγμένων αναλόγων για την αλληλεπίδρασή τους με κυτοχρώματα P450, από την ομάδα της Kύριας Ερευνήτριας Δρ Θεοδώρας Κατσίλα στο Ινστιτούτο Χημικής Βιολογίας του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών. Ειδικότερα μελετήθηκε η μεταβολική σταθερότητα σε ανθρώπινα ηπατικά μικροσώματα και ο μεταβολισμός μέσω των ενζύμων CYP450, για επιλεγμένα θειαζολιδινονικά ανάλογα που έδειξαν ισχυρή αντιλεϊσμανιακή ή/και αντιτρυπανοσωμική δράση και χαμηλή τοξικότητα. Όλα τα ανάλογα έδειξαν αργή ή μέτρια αποδόμηση στα t=60 λεπτά. Επιπλέον, όλα τα ανάλογα αποδείχθηκαν ως ασθενείς ή μέτριοι αναστολείς των ενζύμων του συστήματος CYP450, εκτός από ένα ανάλογο το οποίο αποδείχθηκε ισχυρός αναστολέας της CYP2A6, υποδηλώνοντας ότι μπορεί να προκύψουν αλληλεπιδράσεις των εν δυνάμει φαρμάκων με το CYP2A6. Τέλος, τα αποτελέσματα της φαρμακοκινητικής μελέτης με τη μέθοδο τύπου “Snapshot” παρείχαν πληροφορίες σχετικά με την απορρόφηση, την κατανομή και την κάθαρση επιλεγμένων αναλόγων και έδειξαν ότι οι ενώσεις μπορούν να προχωρήσουν σε πλήρη έλεγχο φαρμοκινητικής και σε in vivo αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας. Τα δεδομένα αυτά οδήγησαν σε περαιτέρω διερεύνηση της αντιλεϊσμανιακής τους δράσης σε θηλυκά BALB/c ποντίκια μολυσμένα με αμαστιγωτά του L. infantum που εκφράζουν λουσιφεράση σε δόση 20 mg/Kg/ημέρα για δέκα ημέρες. Ωστόσο, τα ανάλογα που δοκιμάστηκαν δεν παρουσίασαν σημαντική αντιπαρασιτική δράση στο BALB/c μοντέλο. Δεδομένου ότι οι ενώσεις που εξετάστηκαν είχαν ευνοϊκό φαρμακοκινητικό προφίλ τύπου «snapshot» και μικροσωμική σταθερότητα, η απουσία αντιπαρασιτικής δράσης in vivo μπορεί να οφείλεται σε κακή στόχευση σε συγκεκριμένα όργανα ή σε απροσδόκητες αλλαγές στις ιδιότητες του μορίου. Η μόλυνση από Leishmania έχει ειδικό τροπισμό στα όργανα-στόχους και η βιοσυσσώρευση σε αυτά είναι σημαντική για την κάθαρση των παρασίτων. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για την κατανόηση της έλλειψης αντιλεϊσμανιακής δράσης in vivo όμως μια πιθανή εξήγηση είναι ότι οι ενώσεις, παρά το γεγονός ότι είναι βιοδιαθέσιμες στο αίμα, δεν κατανέμονται σωστά σε όργανα στόχους όπως ο σπλήνας, το ήπαρ και ο μυελός των οστών. Πράγματι, η μορφοποίηση των ενώσεων σε κατάλληλη φαρμακοτεχνική μορφή θα ήταν δυνατόν να επιτρέψει στις ενώσεις να φτάσουν στα όργανα-στόχους και ταυτόχρονα να ενισχυθεί η δράση τους in vivo.