Isolation of new natural neurotrophin mimetics from marine microorganisms

Abstract

Neurodegenerative diseases, varying in epidemiology, clinical symptomatology, neuropathology and underlying physiology, are incurable and debilitating, characterized by progressive structural and, consequently, functional degeneration of neurons and the nervous system connections that are essential for mobility, coordination, strength, sensation and cognition, and are becoming increasingly prevalent, in part due to global population ageing. Even though there are several drugs prescribed to alleviate certain physical or mental symptoms, there is not a single effective medicine that halts or even slows down any neurodegenerative disease. One of the most promising therapeutic approaches against neurodegeneration is the use of neurotrophins. However, their application as therapeutics is limited due to their poor pharmacokinetic properties, low stability and reduced bioavailability, among other reasons. Neurotrophin mimetics, small molecules possessing drug-like pharmacokinetic and pharmacodynamic profiles mimicking or inhibiting the activity of neurotrophins by modulating the action of specific neurotrophin receptors, could be an alternative solution. The screening of microbial natural products represents an important route towards the discovery of novel chemicals for the development of new therapeutic agents and considering that the marine environment hosts unique bacterial and fungal strains, their potential as producers of novel bioactive compounds cannot be overlooked. The geomorphologically and biologically diverse marine ecosystem of the East Mediterranean basin has not been actively investigated for its microbiota, especially from the chemical point of view, thus providing opportunities for the discovery of new chemical entities with biological activity, including neuroprotective activity. Thus, the main aim of the present PhD thesis was to explore microorganisms from the East Mediterranean Sea basin as a source for the isolation and structure elucidation of new natural products that act as neurotrophin mimetics, exhibiting neuroprotective activity. To this end, the extracts of a large panel of microbial strains isolated from marine sediments or macroorganisms collected in Greece were submitted to a preliminary screening of their neuroprotective potential that allowed for the selection of the bacterial strains Bacillus aquimaris BI0987, Bacillus licheniformis BI0394 and Streptomyces sp. BI0788 for chemical investigation. In addition, the fungal strain Penicillium sp. FI0019 was selected for investigation as a representative of the tested marine-derived fungi due to its interesting chemical profile. The selected microbial strains were cultivated in liquid media under appropriate conditions and the crude organic extracts obtained after extraction with mixtures of organic solvents were subjected to extensive chromatographic separations to allow for the isolation of 80 different secondary metabolites, among which 74 (1-74) have been structurally characterized using thorough analyses of their spectroscopic data (mainly NMR and MS) and comparison with literature data, when available. Among them, 10 new natural products (1, 4-6, 35, 41, 46, 47, 59 and 74) have been isolated and characterized. Seventeen metabolites were isolated and identified from the bacterial strain B. aquimaris BI0987, including nine 2,5-diketopiperazines (19-27), four phenolic and polyphenolic derivatives (50, 51, 68 and 71), a carbohydrate derivative (59), and three methacrylates (53-55). Sixteen metabolites were isolated and identified from the bacterial strain B. licheniformis BI0394, including seven 2,5-diketopiperazines (18-23 and 25), four indole derivatives (61-64), four phenolic derivatives (65, 66, 68 and 69) and an acetamide derivative (73). Forty-five metabolites were isolated and identified from the bacterial strain Streptomyces sp. BI0788, including fourteen lactones (1-14), four 2,5-diketopiperazines (20, 21, 23 and 25), sixteen macrolactones (33-48), nine phenolic derivatives (49, 56-58, 65, 67, 68, 70 and 71), a sesquiterpene (52) and an acetamide derivative (74). Furthermore, ten metabolites were isolated and identified from the fungal strain Penicillium sp. FI0019, including three lactones (15-17), four dioxopiperazines (28-31), two quinoline derivatives (32 and 60) and a phenolic derivative (72). Compounds 2-4 and 7-14 were evaluated for their neuroprotective effects on TrkB-expressing NIH-3T3 cells. Among them, metabolites 3, 4, 7, 10, 11, 13 and 14 exhibited significant protective activity on the specific cells through the activation of TrkB, the high-affinity receptor for the Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF), which is known to play a crucial role in neuronal cell survival and maintenance.

Οι νευροεκφυλιστικές ασθένειες, που ποικίλλουν σε επιδημιολογία, κλινική συμπτωματολογία, νευροπαθολογία και υποκείμενη φυσιολογία, είναι ανίατες και εξουθενωτικές, χαρακτηριζόμενες από προοδευτικό δομικό και, κατά συνέπεια, λειτουργικό εκφυλισμό των νευρώνων και των συνάψεων του νευρικού συστήματος που είναι απαραίτητες για την κινητικότητα, τον συντονισμό, τη δύναμη, την αίσθηση και τη γνωστική ικανότητα, και γίνονται όλο και πιο διαδεδομένες, εν μέρει λόγω της γήρανσης του παγκόσμιου πληθυσμού. Παρόλο που υπάρχουν πολλά φάρμακα που συνταγογραφούνται για την ανακούφιση ορισμένων σωματικών ή ψυχικών συμπτωμάτων, δεν υπάρχει ούτε ένα αποτελεσματικό φάρμακο που να σταματά ή έστω και να επιβραδύνει οποιαδήποτε νευροεκφυλιστική ασθένεια. Μία από τις πιο υποσχόμενες θεραπευτικές προσεγγίσεις κατά του νευροεκφυλισμού είναι η χρήση νευροτροφινών. Ωστόσο, η εφαρμογή τους ως θεραπευτικά εργαλεία είναι περιορισμένη λόγω των «κακών» φαρμακοκινητικών τους ιδιοτήτων, της χαμηλής σταθερότητας και της μειωμένης βιοδιαθεσιμότητας, μεταξύ άλλων λόγων. Μιμητικά νευροτροφινών, μικρά μόρια που διαθέτουν φαρμακοκινητικά και φαρμακοδυναμικά προφίλ παρόμοια με φάρμακα και μιμούνται ή αναστέλλουν τη δράση των νευροτροφινών ρυθμίζοντας τη δράση συγκεκριμένων υποδοχέων νευροτροφινών, θα μπορούσαν να είναι μια εναλλακτική λύση. Η αξιολόγηση φυσικών προϊόντων μικροβιακής προέλευσης αντιπροσωπεύει μια σημαντική οδό προς την ανακάλυψη νέων χημικών ουσιών για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών παραγόντων και λαμβάνοντας υπόψη ότι το θαλάσσιο περιβάλλον φιλοξενεί μοναδικά βακτηριακά και μυκητιακά στελέχη, η δυναμική τους ως παραγωγών οργανισμών νέων βιοδραστικών ενώσεων δεν μπορεί να αγνοηθεί. Το γεωμορφολογικά και βιολογικά ποικιλόμορφο θαλάσσιο οικοσύστημα της λεκάνης της Ανατολικής Μεσογείου δεν έχει διερευνηθεί συστηματικά για το μικροβίωμα του, ειδικά όσον αφορά στη χημεία φυσικών προϊόντων, παρέχοντας έτσι ευκαιρίες για την ανακάλυψη νέων χημικών μορίων με βιοδραστικότητα, συμπεριλαμβανομένης της νευροπροστατευτικής δράσης. Έτσι, ο κύριος στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση μικροοργανισμών από τη λεκάνη της Ανατολικής Μεσογείου ως πηγή για την απομόνωση και τον δομικό χαρακτηρισμό νέων φυσικών προϊόντων που δρουν ως μιμητικά νευροτροφινών, επιδεικνύοντας νευροπροστατευτική δράση. Για το σκοπό αυτό, τα εκχυλίσματα ενός μεγάλου αριθμού μικροβιακών στελεχών που έχουν απομονωθεί από θαλάσσια ιζήματα ή μακροοργανισμούς που συλλέχθηκαν στην Ελλάδα υποβλήθηκαν σε προκαταρκτικό έλεγχο της νευροπροστατευτικής τους δράσης που επέτρεψε την επιλογή των βακτηριακών στελεχών Bacillus aquimaris BI0987, Bacillus licheniformis BI0394 και Streptomyces sp. BI0788 για χημική μελέτη. Επιπλέον, το μυκητιακό στέλεχος Penicillium sp. FI0019 επιλέχθηκε για διερεύνηση ως εκπρόσωπος των μυκήτων θαλάσσιας προέλευσης που αξιολογήθηκαν λόγω του ενδιαφέροντος χημικού του προφίλ. Τα επιλεγμένα μικροβιακά στελέχη καλλιεργήθηκαν σε υγρά θρεπτικά μέσα υπό κατάλληλες συνθήκες και τα οργανικά εκχυλίσματα που παραλήφθηκαν μετά από εκχύλιση με μείγματα οργανικών διαλυτών υποβλήθηκαν σε πολλαπλούς χρωματογραφικούς διαχωρισμούς για να οδηγήσουν στην απομόνωση 80 διαφορετικών δευτερογενών μεταβολιτών, μεταξύ των οποίων 74 (1-74) έχουν ταυτοποιηθεί με βάση την ενδελεχή ανάλυση των φασματοσκοπικών τους δεδομένων (κυρίως NMR και MS) και σύγκριση με βιβλιογραφικά δεδομένα, όταν αυτά ήταν διαθέσιμα. Μεταξύ αυτών, απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν 10 νέα φυσικά προϊόντα (1, 4-6, 35, 41, 46, 47, 59 και 74). Δεκαεπτά μεταβολίτες απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν από το βακτηριακό στέλεχος Β. aquimaris ΒΙ0987, συμπεριλαμβανομένων εννέα 2,5-δικετοπιπεραζινών (19-27), τεσσάρων φαινολικών και πολυφαινολικών παραγώγων (50, 51, 68 και 71), ενός υδατάνθρακα (59), και τριών μεθακρυλικών παραγώγων (53-55). Δεκαέξι μεταβολίτες απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν από το βακτηριακό στέλεχος B. licheniformis BI0394, συμπεριλαμβανομένων επτά 2,5-δικετοπιπεραζινών (18-23 και 25), τεσσάρων παραγώγων ινδολίου (61-64), τεσσάρων φαινολικών παραγώγων (65, 66, 68 και 69) και ενός παραγώγου ακεταμιδίου (73). Σαράντα πέντε μεταβολίτες απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν από το βακτηριακό στέλεχος Streptomyces sp. BI0788, συμπεριλαμβανομένων δεκατεσσάρων λακτονών (1-14), τεσσάρων 2,5-δικετοπιπεραζινών (20, 21, 23 και 25), δεκαέξι μακρολακτονών (33-48), εννέα φαινολικών παραγώγων (49, 56-58, 65, 67, 68, 70 και 71), ενός σεσκιτερπενίου (52) και ενός παραγώγου ακεταμιδίου (74). Επιπλέον, δέκα μεταβολίτες απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν από το μυκητιακό στέλεχος Penicillium sp. FI0019, συμπεριλαμβανομένων τριών λακτονών (15-17), τεσσάρων διοξοπιπεραζινών (28-31), δύο παραγώγων κινολίνης (32 και 60) και ενός φαινολικού παραγώγου (72). Οι ενώσεις 2-4 και 7-14 αξιολογήθηκαν για την νευροπροστατευτική τους δράση σε κύτταρα ΝΙΗ-3Τ3 που εκφράζουν τον υποδοχέα TrkB. Μεταξύ αυτών, οι μεταβολίτες 3, 4, 7, 10, 11, 13 και 14 εμφάνισαν σημαντική προστατευτική δράση στα συγκεκριμένα κύτταρα μέσω της ενεργοποίησης του TrkB, του υψηλής συγγένειας υποδοχέα για την νευροτροφίνη Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF), ο οποίος είναι γνωστό ότι παίζει κρίσιμο ρόλο στην επιβίωση και την διατήρηση των νευρώνων.