Deciphering the molecular responses of the striatal medium spiny neuron (MSN) subpopulations upon chronic moderate dopamine depletion and L-DOPA application in a rAAV-alpha-Synuclein mouse model

Abstract

Parkinson's disease (PD) is an age-related neurodegenerative disorder, worldwide affecting million of people with an upward trend in the next decades. PD hallmarks include the degeneration of the nigrostriatal dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta, and the intraneuronal accumulation of aggregated alpha-Synuclein. PD patients, upon dopamine deficiency in the basal ganglia circuitry, develop cardinal motor dysfunctions accompanied with early-onset and late-stage non-motor symptoms. Genetic and environmental factors contribute significantly to neurodegeneration, yet a comprehensive etiology of PD still remains elusive. The majority of PD cases are sporadic, modified by gene-environmental interactions, while the familial PD only represents a 5%-10% of the total cases. The pathophysiology underlying PD encompasses manifold molecular and cellular mechanisms, however, it is not entirely understood. Gene mutations, protein clearance machinery deficits, mitophagy deficits, oxidative stress and neuroinflammation are regarded the top culprits leading to alpha-Synuclein aggregation and pathology. While the aggregated alpha-Synuclein propagates throughout the brain, dopaminergic neuronal somata and nigrostriatal fibers are primarily susceptible to degeneration and cell death. Dopaminergic nigrostriatal fibers provide the striatum, a major nucleus of basal ganglia, with the neurotransmitter dopamine, regulating the motor pathways. Dopamine deficiency can disturb the imbalance between „direct“ and „indirect“ motor pathways resulting in PD motor symptoms. No curative therapies to prevent disease progression are yet available, and all pharmacological interventions aim to PD symptoms alleviation. To date, L-DOPA remains the gold standard among the dopaminergic therapeutic applications for motor symptoms management in PD. However, dopamine substitution is not always satisfactory in the long run, when PD patients often develop motor fluctuations and L-DOPA-induced dyskinesias (LID). Nevertheless, in early stages of PD upon L-DOPA application, patients enjoy a „honeymoon period“, and they display a long duration response (LDR) that requires weeks to build up and days to vanish without manifesting motor fluctuations. LDR cannot be explained by drug kinetics, and it is postulated that the buffering capacity of LDR effect could involve adaptive homeostatic plastic synaptic alterations in the basal ganglia circuitry. In this study, I examined the synaptic plasticity-related molecular responses of different medium spiny neuron (MSN) subpopulations in mouse striatum upon a moderate dopamine depletion and chronic L-DOPA administration. Striatum is predominantly occupied by the MSN GABAergic neurons, which can be classified into two major subpopulations, D1-MSNs and D2-MSNs, mainly based on their D1 and D2 dopamine receptor expression, respectively. D1 dopamine receptor stimulation activates downstream signaling cascades that positively regulates the „direct“ motor pathway through D1-MSN potentiation. In contrast, D2 dopamine receptor stimulation exerts inhibitory downstream signaling suppressing D2-MSN activity, and eventually the „indirect“ pathway, promoting normal mobility. Dopamine depletion and substitution can modulate the activity of MSN striatal neurons leading to motor pathways deregulation and motor deficits. D1 and D2 dopamine receptor downstream cascades are tightly linked to signaling pathways, such as cAMP, calcium and MAPK-ERK1/2 pathways, which regulate the synaptic plasticity in MSNs. These pathways, upon abnormal dopamine levels in striatum can establish synaptic plastic changes shaping the excitation status of MSN neurons. MSN populations are highly heterogeneous, and they can be subclustered further into subpopulations with discrete gene profiles and distinct molecular responses upon dopamine depletion and substitution. So far, most scientific evidence, about the molecular responses in striatum, are derived from animal models with extensive dopaminergic loss, displaying Abnormal Involuntary Movements (AIM) after L-DOPA administration (LID animal models). However, little is known about the molecular signaling responses, the homeostatic compensatory mechanisms and the synaptic plastic adaptations that are established in MSN subpopulations upon a moderate dopamine depletion in mouse striatum, and chronic L-DOPA administration that does not elicit AIMs. Herewith, in order to establish a mouse model with a moderate dopamine depletion in striatum, I injected the serotype 2/7 rAAV encoding human alpha-Synuclein A53T mutant, into the substantia nigra (SN). Human alpha-Synuclein ectopic overexpression in SN ensures a progressive and moderate dopaminergic neurodegeneration in both SN and striatum. Moreover, A53T mutant can enhance the protein aggregation resulting in early parkinsonism. Indeed, alpha-Synuclein overexpression by means of rAAV vector led to a partial dopaminergic degeneration in SN, and elicited mild asymmetry of forelimb use in a cylinder test. Furthermore, dopamine depleted mice underwent AIM recordings without scoring dyskinetic phenotypes. Then, by employing enzymatic dissociation protocol, FACS sorting and Single-cell transcriptomic analysis, I clustered the dorsal striatal neuronal and non-neuronal subpopulations. After unbiased Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) clustering, I identified the major D1- and D2-MSN populations based on commonly known marker genes, and classified them into subclusters. D1-MSN subclusters displayed a big number of differentially expressed genes (DEGs), being consistent with previous studies. Strikingly, individual D1- and D2-MSN subclusters exhibited distinct sets of DEGs upon dopamine depletion and substitution, with unique upregulated and downregulated genes between comparisons, indicating the heterogeneity in terms of molecular responses among MSN subclusters. Several differentially expressed genes, especially in the D1-MSN subclusters, were associated with the cAMP-calcium-MAPK signaling pathway modulators and components. Dopamine depletion and substitution, by modulating the normal D1 and D2 receptor signaling, induced molecular responses that likely could establish synaptic maladaptive changes leading to aberrant MSN activity. Nevertheless, homeostatic compensatory molecular responses emerged possibly to counteract the deregulated signaling pathways in MSN subclusters, and consequently to restore their normal activity phenotype. These emerging homeostatic responses possibly explains the mild forelimb asymmetry upon dopamine depletion in this animal model, as well as the absence of AIMs after chronic L-DOPA administration. Finally, in this study I attempted to identify the striatal glial subpopulations, and to address the glial activation phenotypes upon different conditions. Conclusively, with this work, I established a mouse model that could be used to investigate the molecular signaling responses and homeostatic mechanisms among the different MSN subpopulations in early parkinsonism with a moderate dopamine deficiency, as well as the early stages of dyskinesia triggering.

Η νόσος του Πάρκινσον (PD) είναι μια νευροεκφυλιστική διαταραχή που σχετίζεται με την ηλικία, επηρεάζοντας παγκοσμίως εκατομμύρια ανθρώπους με ανοδική τάση τις επόμενες δεκαετίες. Τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα της νόσου του Πάρκινσον περιλαμβάνουν τον εκφυλισμό των ντοπαμινεργικών νευρώνων στη μέλαινα ουσία και την ενδονευρωνική συσσώρευση συσσωματωμένης άλφα-Συνουκλεΐνης. Οι ασθενείς με νόσο του Πάρκινσον, κατά την ανεπάρκεια ντοπαμίνης στο κύκλωμα των βασικών γαγγλίων, αναπτύσσουν βασικές κινητικές δυσλειτουργίες συνοδευόμενες από μη κινητικά συμπτώματα πρώιμης και όψιμης έναρξης. Γενετικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες συμβάλλουν σημαντικά στον νευροεκφυλισμό, ωστόσο μια ολοκληρωμένη αιτιολογία της νόσου παραμένει αόριστη. Η πλειοψηφία των περιπτώσεων της νόσου του Πάρκινσον είναι σποραδικές, ως αποτέλεσμα γονιδιακών και περιβαλλοντικών αλληλεπιδράσεων, ενώ η οικογενής νόσος αντιπροσωπεύει μόνο το 5%-10% των συνολικών περιπτώσεων. Η παθοφυσιολογία στην οποία βασίζεται η νόσος του Πάρκινσον περιλαμβάνει πολλαπλούς μοριακούς και κυτταρικούς μηχανισμούς, ωστόσο, δεν είναι πλήρως κατανοητή. Γονιδιακές μεταλλάξεις, βλάβες του μηχανισμού κάθαρσης πρωτεϊνών και μιτοχονδρίων, οξειδωτικό στρες και νευροφλεγμονή θεωρούνται οι κορυφαίοι ένοχοι που οδηγούν σε συσσώρευση άλφα-Συνουκλεΐνης και παθολογία. Ενώ η συσσωρευμένη άλφα-Συνουκλεΐνη διαδίδεται σε όλο τον εγκέφαλο, τα σώματα και οι νευράξονες των ντοπαμινεργικών νευρώνων είναι κυρίως ευαίσθητα στον εκφυλισμό και τον κυτταρικό θάνατο. Οι ντοπαμινεργικές ίνες παρέχουν στο ραβδωτό σώμα, έναν σημαντικό πυρήνα των βασικών γαγγλίων, το νευροδιαβιβαστή ντοπαμίνη, ρυθμίζοντας τις κινητικές οδούς. Η ανεπάρκεια ντοπαμίνης μπορεί να διαταράξει την ανισορροπία μεταξύ «άμεσων» και «έμμεσων» κινητικών οδών με αποτέλεσμα τα κινητικά συμπτώματα της νόσου του Πάρκινσον. Δεν υπάρχουν ακόμη διαθέσιμες θεραπείες για την πρόληψη της εξέλιξης της νόσου και όλες οι φαρμακολογικές παρεμβάσεις στοχεύουν στην ανακούφιση των συμπτωμάτων. Μέχρι σήμερα, η L-DOPA παραμένει η χρυσή τομή μεταξύ των θεραπευτικών εφαρμογών για τη διαχείριση των κινητικών συμπτωμάτων στη νόσο του Πάρκινσον. Ωστόσο, η υποκατάσταση ντοπαμίνης δεν είναι πάντα ικανοποιητική μακροπρόθεσμα, όταν οι ασθενείς συχνά αναπτύσσουν κινητικές διακυμάνσεις και δυσκινησίες που προκαλούνται από τη χορήγηση της L-DOPA (LID). Παρ 'όλα αυτά, στα αρχικά στάδια της νόσου κατά την εφαρμογή της L-DOPA, οι ασθενείς απολαμβάνουν μια «περίοδο μήνα του μέλιτος» και εμφανίζουν μια απόκριση μεγάλης διάρκειας (LDR) που απαιτεί εβδομάδες για να συσσωρευτεί και ημέρες για να εξαφανιστεί χωρίς να εκδηλώνονται κινητικές διακυμάνσεις. Η LDR δεν μπορεί να εξηγηθεί από την κινητική του φαρμάκου και θεωρείται ότι η ρυθμιστική ικανότητα της επίδρασης LDR θα μπορούσε να περιλαμβάνει προσαρμοστικές ομοιοστατικές πλαστικές συναπτικές αλλαγές στα κυκλώματα των βασικών γαγγλίων. Σε αυτή τη μελέτη, εξέτασα τις μοριακές αποκρίσεις που σχετίζονται με τη συναπτική πλαστικότητα διαφορετικών υποπληθυσμών των μεσαίων ακανθωδών νευρώνων (MSN) στο ραβδωτό σώμα μυός μετά από μέτρια ανεπάρκεια ντοπαμίνης και χρόνια χορήγηση L-DOPA. Το ραβδωτό σώμα καταλαμβάνεται κυρίως από τους MSN GABAεργικούς νευρώνες, οι οποίοι μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο κύριους υποπληθυσμούς, τους D1-MSNs και τους D2-MSNs, κυρίως με βάση την έκφραση των υποδοχέων ντοπαμίνης D1 και D2 στην επιφάνειά τους, αντίστοιχα. Η διέγερση των υποδοχέων ντοπαμίνης D1 ενεργοποιεί τους καταρράκτες σηματοδότησης που ρυθμίζουν θετικά την "άμεση" κινητική οδό μέσω της ενίσχυσης δράσης των D1-MSN νευρώνων. Αντίθετα, η διέγερση των υποδοχέων ντοπαμίνης D2 ασκεί ανασταλτική σηματοδότηση καταστέλλοντας τη δραστηριότητα των D2-MSN νευρώνων και τελικά την "έμμεση" οδό, προωθώντας μια φυσιολογική κινητικότητα. Η ανεπάρκεια και η υποκατάσταση ντοπαμίνης μπορεί να ρυθμίσει τη δραστηριότητα των νευρώνων του ραβδωτού σώματος οδηγώντας σε απορρύθμιση των κινητικών οδών και κινητικά προβλήματα. Οι καταρράκτες των υποδοχέων ντοπαμίνης D1 και D2 συνδέονται στενά με οδούς σηματοδότησης, όπως οι οδοί cAMP, ασβεστίου και MAPK-ERK1/2, οι οποίες ρυθμίζουν τη συναπτική πλαστικότητα των MSN νευρώνων. Αυτές οι οδοί, μετά από μη φυσιολογικά επίπεδα ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα μπορούν να δημιουργήσουν συναπτικές πλαστικές αλλαγές που διαμορφώνουν την κατάσταση διέγερσης των νευρώνων MSN. Οι πληθυσμοί των MSN νευρώνων είναι εξαιρετικά ετερογενείς και μπορούν να υποομαδοποιηθούν περαιτέρω σε υποπληθυσμούς με διακριτά γονιδιακά προφίλ και διακριτές μοριακές αποκρίσεις κατά την ανεπάρκεια και την υποκατάσταση της ντοπαμίνης. Μέχρι στιγμής, τα περισσότερα επιστημονικά στοιχεία, σχετικά με τις μοριακές αποκρίσεις στο ραβδωτό σώμα, προέρχονται από ζωικά μοντέλα με εκτεταμένη ντοπαμινεργική απώλεια, εμφανίζοντας μη φυσιολογικές ακούσιες κινήσεις (AIM) μετά τη χορήγηση L-DOPA (ζωικά μοντέλα LID). Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τις αποκρίσεις μοριακής σηματοδότησης, τους ομοιοστατικούς αντισταθμιστικούς μηχανισμούς και τις συναπτικές πλαστικές προσαρμογές που δημιουργούνται στους υποπληθυσμούς των MSN νευρώνων μετά από μέτρια ανεπάρκεια ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα ποντικού και χρόνια χορήγηση L-DOPA που δεν προκαλεί AIMs. Έτσι, προκειμένου να δημιουργηθεί ένα μοντέλο μυός με μέτρια ανεπάρκεια ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα, προχώρησα σε στερεοτακτική ένεση του 2/7 rAAV φορέα, που κωδικοποιεί την ανθρώπινη μεταλλαγμένη άλφα-Συνουκλεΐνη A53T, στη μέλαινα ουσία (SN). Η υπερέκφραση της ανθρώπινης άλφα-Συνουκλεΐνης στη μέλαινα ουσία εξασφαλίζει έναν προοδευτικό και μέτριο ντοπαμινεργικό νευροεκφυλισμό τόσο στην ίδια τη μέλαινα ουσία όσο και στο ραβδωτό σώμα. Επιπλέον, η μετάλλαξη A53T μπορεί να ενισχύσει τη συσσώρευση πρωτεϊνών με αποτέλεσμα τον πρώιμο παρκινσονισμό. Πράγματι, η υπερέκφραση της άλφα-Συνουκλεΐνης μέσω του φορέα rAAV οδήγησε σε μερική ντοπαμινεργική εκφύλιση στη μέλαινα ουσία και προκάλεσε ήπια ασυμμετρία της χρήσης του πρόσθιου άκρου των ζώων σε δοκιμή κυλίνδρου. Επιπλέον, τα ποντίκια με ανεπάρκεια στη ντοπαμίνη υποβλήθηκαν σε καταγραφές AIM χωρίς να εκφράσουν δυσκινητικούς φαινότυπους. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας ενζυματικό πρωτόκολλο διάστασης (tissue dissociation), διαλογή FACS (sorting) και μεταγραφομική ανάλυση κυττάρου (single-cell transcriptomics), συγκέντρωσα τους νευρωνικούς και μη νευρωνικούς υποπληθυσμούς του ραχιαίου ραβδωτού. Μετά από αμερόληπτη ομαδοποίηση Ομοιόμορφης Πολλαπλής Προσέγγισης και Προβολής (UMAP), εντόπισα τους κύριους πληθυσμούς D1- και D2-MSN με βάση κοινώς γνωστά γονίδια-δείκτες και τους ταξινόμησα σε υποομάδες. Οι υποομάδες των D1-MSN νευρώνων εμφάνισαν μεγάλο αριθμό γονιδίων διαφορικής έκφρασης (DEGs), που συνάδουν με προηγούμενες μελέτες. Εντυπωσιακά, μεμονωμένες υποομάδες D1- και D2-MSN νευρώνων παρουσίασαν διακριτά σύνολα DEGs κατά την ανεπάρκεια και την υποκατάσταση της ντοπαμίνης, με μοναδικά γονίδια των οποίων η έκφραση ρυθμίζεται προς τα πάνω και προς τα κάτω μεταξύ των συγκρίσεων, υποδεικνύοντας την ετερογένεια όσον αφορά τις μοριακές αποκρίσεις μεταξύ των υποομάδων των MSN νευρώνων. Αρκετά γονίδια που εκφράζονται διαφορικά, ειδικά στις υποομάδες των D1-MSN νευρώνων, συσχετίστηκαν με τους ρυθμιστές και τα συστατικά της οδού σηματοδότησης cAMP-calcium-MAPK. Η ανεπάρκεια και η υποκατάσταση της ντοπαμίνης, ρυθμίζοντας τη D1 και D2 σηματοδότηση, επάγουν μοριακές αποκρίσεις που πιθανώς θα μπορούσαν να δημιουργήσουν συναπτικές δυσπροσαρμοστικές αλλαγές που οδηγούν σε ανώμαλη δραστηριότητα των MSN νευρώνων. Παρ 'όλα αυτά, ομοιοστατικές αντισταθμιστικές μοριακές αποκρίσεις προέκυψαν πιθανώς για να εξουδετερώσουν τις απορρυθμισμένες οδούς σηματοδότησης στις υποομάδες των MSN νευρώνων και κατά συνέπεια, να αποκαταστήσουν τον φαινότυπο της φυσιολογικής δραστηριότητάς τους. Αυτές οι αναδυόμενες ομοιοστατικές αποκρίσεις πιθανώς εξηγούν την ήπια ασυμμετρία του πρόσθιου άκρου των ζώων κατά την ανεπάρκεια της ντοπαμίνης σε αυτό το ζωικό μοντέλο, καθώς και την απουσία AIMs μετά από χρόνια χορήγηση L-DOPA. Τέλος, σε αυτή τη μελέτη προσπάθησα να προσδιορίσω τους υποπληθυσμούς των νευρογλοιακών κυττάρων του ραβδωτού και να εντοπίσω τους φαινότυπους ενεργοποίησής τους στις διαφορετικές πειραματικές συνθήκες. Συμπερασματικά, με αυτή την εργασία, δημιούργησα ένα μοντέλο μυός που θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για τη διερεύνηση των αποκρίσεων μοριακής σηματοδότησης και των ομοιοστατικών μηχανισμών μεταξύ των διαφόρων υποπληθυσμών των MSN νευρώνων στον πρώιμο παρκινσονισμό με μέτρια ανεπάρκεια ντοπαμίνης, καθώς και στα πρώτα στάδια ενεργοποίησης της δυσκινησίας.