Μελέτη του κυτταρικού θανάτου με τη χρήση νέων βιοδεικτών

Abstract

Immunogenic cell death (ICD) is a form of regulated cell death (RCD), characterized primarily by the release of damage-associated molecular patterns (DAMPs) from dying cancer cells. DAMPs or alarmins are molecules that under normal conditions are localized in various cellular compartments (e.g., in the nucleus, in the endoplasmic reticulum, etc.), where they play roles in essential cellular functions. During ICD, these molecules are modified intracellularly through oxidation or proteolysis and are then exocytosed, eliciting immune responses. Their notable features include both immunogenic and immunostimulatory properties. DAMPs are classified into two categories: a) DAMPs released into the extracellular space by the dying/dead cell [e.g., high-mobility group protein B1 (HMGB1), adenosine triphosphate (ATP), etc.] and b) DAMPs that are expressed on the surface of dying/dead cell [e.g., calreticulin (CRT), heat shock proteins (HSPs), etc.].A series of studies has demonstrated that the member of the thymosin family, prothymosin α (proTα) and its immunoreactive decapeptide proTα(100–109) act as DAMPs. ProTα, an acidic protein of 109–110 amino acids, is highly conserved among mammals and is expressed in the cells of all tissues. It plays a dual role, as it participates intracellularly in various important cellular processes (e.g., DNA replication, transcription, cytoprotection), while, extracellularly, it exhibits significant immunoregulatory activity [e.g., induction of major histocompatibility complex (MHC) class I molecule expression, maturation of dendritic cells (DCs), enhancement of the phagocytic capacity of neutrophils, natural killer (NK) cell and lymphokine-activated killer (LAK) cell cytotoxicity, T cell proliferation, etc.]. The source of its immunoregulatory activity resides in its carboxy-terminal fragment, specifically within the decapeptide proTα(100–109). This decapeptide is released from dying cells following truncation of proTα by caspases (mainly caspase-3 and caspase-7), thereby exerting immunoregulatory effects. In previous in vitro studies, it has been shown that proTα and proTα(100–109) signal through the Toll-like receptor (TLR) 4 on DCs, inducing their maturation. Mature DCs uptake antigenic epitopes from cancer cells and, via antigen presentation, induce the activation of autologous helper T lymphocytes, which are polarized to T helper 1 (Th1) cells. Through the production of the appropriate cytokines, these cells enhance the cytolytic program of activated cytotoxic T lymphocytes (CTLs), which ultimately eliminate cancer cells. The aim of the present thesis is twofold: firstly, to further study the extracellular role of proTα and proTα(100–109), and secondly, to investigate the diagnostic and predictive potential of the DAMP proTα(100–109).Taking into account all the available in vitro data, we initially examined the therapeutic efficacy of proTα and proTα(100–109) in vivo, using a melanoma model in C57BL/6 mice. The animals were subcutaneously inoculated with cells of the syngeneic murine melanoma cell line B16.F1. After the appearance of palpable tumors, animals were divided into groups that received therapeutically intraperitoneal administrations of either phosphate-buffered saline (PBS) (negative control), granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), proTα, proTα(100–109), or a scrambled peptide (i.e., a synthetic peptide with the same amino acid composition as proTα(100–109) but with a different primary structure). In parallel, a peptide extract (AWE) produced from cancer cells—i.e., a peptide vaccine composed of melanoma cell epitopes isolated from the surface of B16.F1 cells—was administered. Two cycles of treatment were performed, and the animals were monitored for the mass of their tumors. A significant reduction in tumor growth rate was observed in mice that received the therapeutic combination proTα/AWE and proTα(100–109)/AWE, compared to the other groups. Additionally, in tumors excised from animals treated with proTα/AWE and proTα(100–109)/AWE, a significant reduction in the extent of necrotic areas, melanin accumulation, vascular and smooth muscle infiltration, and an increased infiltration by T lymphocytes was observed. Moreover, an induction of both tumor-specific (T cell-mediated) and non tumor-specific (NK and LAK cell-mediated) cytotoxicity was observed in splenocytes of these animals, along with increased levels of pro-inflammatory and Th1-type cytokines in their serum. Subsequently, we investigated the safety profile of proTα, proTα(100–109), and the extensively studied N-terminal peptide fragment of proTα thymosin α1 (Tα1), using in silico, in vitro, and in vivo approaches. The in silico analysis, performed with the programs ToxinPred, AllerTOP, and AllergenFP, indicated that all three peptides are neither toxic nor allergenic. In vitro, analysis using the MTT assay and flow cytometry (FC) after staining with annexin V and propidium iodide (PI) did not reveal any toxicity of the three peptides against cancer cell lines or healthy donor-derived peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), compared to doxorubicin (positive control). Further assessment, using the thymidine incorporation assay, showed no effect of the peptides on the proliferative capacity of PBMCs. In addition, FC analysis after staining with Vybrant Dye Cycle Violet, did not reveal any impact on the phases of the cell cycle. These results were further confirmed in vivo in C57BL/6 mice, which received intraperitoneally PBS (negative control) and high doses of proTα, proTα(100–109), and Tα1. Specifically, no morphological alterations were observed in the organs (lungs, liver, spleen, kidneys) of the animals that received the three peptides, nor were there any differences in body weight, compared to the control group. Moreover, the levels of functional renal (urea, creatinine) and hepatic (SGPT, SGOT) biomarkers in these animals remained at levels comparable to those of the control group. These findings indicate that both proTα and proTα(100–109) show anticancer therapeutic efficacy, as they induce Th1-type immune responses in vivo, and exhibit an excellent safety profile, causing no toxicity either in vitro or in vivo. In order to study the predictive potential of proTα(100–109), we initially optimized the method of its quantitative determination—an in-house competitive ELISA—using rabbit anti-proTα IgG polyclonal antibodies. The useful range of the assay after optimization was 0.1 ng/mL to 10 μg/mL. Subsequently, we determined the physiological levels of the peptide in the plasma of healthy individuals. A total of 523 plasma samples from healthy donors (226 men and 297 women), aged 0 to 96 years, were analyzed. The mean concentration of proTα(100–109) was very low, 0.508 ng/mL, and was independent of both gender and age. Next, we examined the correlation between the levels of proTα(100–109) and the percentage of ICD induction. This correlation was studied in culture supernatants of cancer cells driven to ICD after exposure to pharmaceutical agents or ionizing radiation. In solid tumor and multiple myeloma (MM) cells that were cultured in the presence of doxorubicin, as well as the proteasome inhibitor bortezomib (BTZ), respectively, or were exposed to γ-irradiation, we observed a dose-dependent simultaneous increase in both the levels of proTα(100–109) and the percentages of early apoptotic cells. Furthermore, the concentration of proTα(100–109) was determined in the plasma of 11 patients with MM, before and 24 hours after treatment with BTZ. In 6 of 11 patients, a significant increase was observed; in 4 patients the levels remained stable, while only in one patient a decrease was recorded. In parallel, we conducted a kinetic study in 4 different MM patients, in whom the peptide concentration was determined before and 6, 12, 24, and 48 hours after treatment with BTZ. Based on these results, the time interval between 24 and 48 hours after treatment was indicated as the optimal time point for the quantitative determination of proTα(100–109). A correlation between the increase in peptide levels and patients’ response to treatment was observed. Within the framework of our in vitro experiments, we exposed myeloma cell lines to the pharmaceutical agent Belantamab mafodotin (BMF), a conjugate of Belantamab, a monoclonal antibody, specific for the B cell maturation antigen (BCMA), and the toxin MMAF, which, according to the literature, acts as an indirect ICD inducer. After verifying BCMA expression on H929 and L363 cells by flow cytometry (with H929 cells expressing higher levels of BCMA than L363), we determined via the MTT assay that H929 cells are more sensitive to BMF. Simultaneously, we observed an increase in the percentages of early and late apoptosis in H929 and L262 cells, cultured for 24 hours in the presence of BMF, along with a concurrent increase in the expression levels of CRT—a marker of the early stages of ICD induction, HMGB1, a marker of the late apoptotic stages, and the levels of proTα(100–109).The effect of BMF was also studied in patients with MM, where, using FC and multicolor staining, we determined the percentages of circulating clonal plasma cells (CPCs) before and 24 hours after treatment, for 2 cycles of therapy with a 2-month interval. A significant reduction in the percentages of CPCs was observed after the first cycle, and after the second cycle, CPCs were no longer detectable in patients’ blood. In parallel, we also confirmed the specificity of the drug for the B cell population by studying the effect of BMF on cells of the immune system (B and T lymphocytes, monocytes, neutrophils, and NK cells) in the same patients. Since BMF acts as an ICD inducer, the expression levels of CRT and the concentrations of proTα(100–109) and HMGB1 were also determined. We found that the average concentrations of the DAMPs proTα(100–109) and HMGB1 in MM patients increased 24 hours after the first cycle of therapy; notably, in patients who achieved a very good partial response (VGPR), the levels were higher compared to those in patients who achieved only a partial response (PR) to BMF treatment. Finally, using principal component analysis, the levels of proTα(100–109) and HMGB1 were correlated with the patients’ three-month treatment response. The analysis indicated that determining ICD levels after the first cycle of therapy can predict patients’ response-to-treatment to BMF over a 3-month period. Based on the above, the induction of ICD by therapeutic anticancer agents can be assessed by measuring the levels of the established biomarkers HMGB1 and CRT as well as the novel biomarker proTα(100–109), both in vitro and ex vivo, in the peripheral blood of cancer patients. The combined increase in the levels of these three DAMPs may serve as a predictive biomarker for the early positive therapeutic response in patients with cancer.

Ο ανοσογονικού τύπου αποπτωτικός θάνατος (ICD) είναι μια μορφή ρυθμιζόμενου κυτταρικού θανάτου (RCD), με κύριο χαρακτηριστικό την απελευθέρωση, από το υπό θάνατο καρκινικό κύτταρο, μοριακών μοτίβων σχετιζόμενων με βλάβη (DAMPs). Τα DAMPs ή αλαρμίνες είναι μόρια που, υπό φυσιολογικές συνθήκες, εντοπίζονται σε ποικίλα κυτταρικά διαμερίσματα (π.χ. στον πυρήνα, στο ενδοπλασματικό δίκτυο, κτλ.) διαδραματίζοντας ρόλο σε σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες. Κατά τον ICD, τροποποιούνται ενδοκυτταρικά μέσω οξείδωσης ή πρωτεόλυσης και εξωκυτταρώνονται, εγείροντας ανοσολογικές αποκρίσεις. Σημαντικά χαρακτηριστικά τους είναι οι ανοσογονικές και οι ανοσοενισχυτικές τους ιδιότητες. Τα DAMPs διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: α) DAMPs που απελευθερώνονται στον εξωκυττάριο χώρο του υπό θάνατο/νεκρού κυττάρου [π.χ. η πρωτεΐνη υψηλής κινητικότητας της ομάδας Β1 (HMGB1), η τριφωσφορική αδενοσίνη (ATP), κ.α.] και β) DAMPs που εκφράζονται στην επιφάνεια του υπό θάνατο/νεκρού κυττάρου [π.χ. η καλρετικουλίνη (CRT), οι πρωτεΐνες θερμικού σοκ (HSPs), κ.α.]. Σειρά μελετών έχει καταδείξει ως DAMPs το μέλος της οικογένειας των θυμοσινών, προθυμοσίνη α (προΤα), και το ανοσοδραστικό της δεκαπεπτίδιο προΤα(100-109). Η προΤα, μια όξινη πρωτεΐνη, μήκους 109-110 αμινοξέων, παρουσιάζει υψηλή συντηρητικότητα στα θηλαστικά και εκφράζεται στα κύτταρα όλων των ιστών. Επιτελεί διττό ρόλο, καθώς ενδοκυτταρικά συμμετέχει σε ποικίλες σημαντικές κυτταρικές διεργασίες (π.χ. αντιγραφή, μεταγραφή, κυτταροπροστασία), ενώ εξωκυτταρικά εμφανίζει σημαντική ανοσορυθμιστική δράση [π.χ. επαγωγή έκφρασης των μορίων του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (ΜΗC) τάξης Ι, ωρίμανσης δενδριτικών κυττάρων (DCs), φαγοκυτταρικής ικανότητας ουδετερόφιλων, κυτταροτοξικότητας από φυσικά φονικά (ΝΚ) και ενεργοποιημένα από λεμφοκίνες φονικά (LAK) κύτταρα, πολλαπλασιασμού Τ λεμφοκυττάρων, κ.α.]. Η πηγή της ανοσορυθμιστικής της δράσης εδράζεται στο καρβοξυτελικό της άκρο και συγκεκριμένα στο δεκαπεπτίδιο προΤα(100-109). Το δεκαπεπτίδιο απελευθερώνεται από τα αποπτωτικά κύτταρα μετά τη δράση κασπασών (κυρίως των κασπασών-3 και -7) στην προΤα, δρώντας ανοσορυθμιστικά. Σε προηγούμενες in vitro μελέτες, έχει δειχθεί ότι η προΤα και το προΤα(100-109) σηματοδοτούν, μέσω του υποδοχέα τύπου Toll (TLR) 4, στα DCs επάγοντας την ωρίμανσή τους. Τα ώριμα DCs προσλαμβάνουν αντιγονικούς επιτόπους καρκινικών κυττάρων και μέσω αντιγονοπαρουσίασης επάγουν την ενεργοποίηση αυτόλογων βοηθητικών Τ λεμφοκυττάρων, τα οποία πολώνονται προς βοηθητικά κύτταρα τύπου 1 (Τh1), και μέσω της παραγωγής κατάλληλων κυτταροκινών, ενισχύουν το κυτταρολυτικό πρόγραμμα ενεργοποιημένων κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων (CTLs), τα οποία τελικά λύουν τα καρκινικά κύτταρα. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι αφενός, η περαιτέρω μελέτη της εξωκυτταρικής δράσης των προΤα και προΤα(100-109) και αφετέρου, η μελέτη του διαγνωστικού και προβλεπτικού δυναμικού του DAMP προΤα(100-109). Λαμβάνοντας υπόψη τα ως τώρα in vitro δεδομένα, αρχικά εξετάσαμε και in vivo τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα της προΤα και του προΤα(100-109), με τη χρήση μοντέλου μελανώματος σε ποντίκια της φυλής C57BL/6. Τα πειραματόζωα ενοφθαλμίστηκαν υποδόρια με κύτταρα της συγγενικής μελανωματικής σειράς ποντικού B16.F1. Μετά την εμφάνιση ψηλαφίσιμων όγκων, τα ζώα χωρίστηκαν σε ομάδες, στις οποίες πραγματοποιήθηκε ενδοπεριτοναϊκή θεραπευτική χορήγηση αλατούχου φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (PBS) (αρνητικός μάρτυρας), παράγοντα διέγερσης σχηματισμού αποικιών κοκκιοκυττάρων-μακροφάγων (GM-CSF), προΤα, προΤα(100-109) ή scrambled πεπτιδίου [συνθετικού πεπτιδίου με την ίδια αμινοξική σύσταση με το προΤα(100-109), αλλά διαφορετική πρωτοταγή δομή]. Παράλληλα, χορηγήθηκε πεπτιδικό εκχύλισμα (AWE) καρκινικών κυττάρων, δηλαδή πεπτιδικό εμβόλιο αποτελούμενο από επιτόπους των μελανωματικών κυττάρων που απομονώθηκαν από την επιφάνεια των B16.F1. Χορηγήθηκαν δύο κύκλοι θεραπείας, και τα πειραματόζωα παρακολουθήθηκαν ως προς το μέγεθος των όγκων. Παρατηρήθηκε σημαντική μείωση του ρυθμού ανάπτυξης των όγκων στα ποντίκια που έλαβαν θεραπευτικά τον συνδυασμό προΤα/AWE και προΤα(100-109)/ΑWE έναντι των υπολοίπων ομάδων. Παράλληλα, στους όγκους των πειραματοζώων που έλαβαν θεραπευτικά προΤα/AWE και προΤα(100-109)/ΑWE παρατηρήθηκε σημαντική μείωση της έκτασης των νεκρωτικών περιοχών, μείωση της συσσώρευσης μελανίνης, μικρότερη διήθηση των αγγείων και των λείων μυών, και αυξημένη διήθηση των όγκων από Τ λεμφοκύτταρα. Επιπλέον, παρατηρήθηκε επαγωγή ογκοειδικής (Τ-μεσολαβούμενης) αλλά και μη ειδικής για τον όγκο (ΝΚ- και LAK-μεσολαβούμενης) κυτταροτοξικότητας στα σπληνοκύτταρα των πειραματοζώων των εν λόγω ομάδων και αυξημένα επίπεδα προφλεγμονωδών και Th1-τύπου κυτταροκινών στον ορό του αίματός τους. Στη συνέχεια, μελετήσαμε το προφίλ ασφαλείας της προΤα, του προΤα(100-109), αλλά και του εκτενώς μελετημένου, αμινοτελικού θραύσματος της προΤα θυμοσίνης α1 (Τα1) in silico, in vitro και in vivo. Η in silico ανάλυση, μέσω των προγραμμάτων ToxinPred, AllerTOP και AllergenFP έδειξε ότι τα τρία πεπτίδια δεν είναι τοξικά ή αλλεργιογόνα. In vitro, η ανάλυση με τη δοκιμασία ΜΤΤ, αλλά και με κυτταρομετρία ροής (FC) έπειτα από χρώση με αννεξίνη V και ιωδιούχο προπίδιο (PI), δεν κατέδειξε τοξικότητα των τριών πεπτιδίων έναντι κυττάρων καρκινικών σειρών ή μονοπύρηνων περιφερικού αίματος (PBMCs) υγιών δοτών συγκριτικά με τη δοξορουβικίνη (θετικός μάρτυρας). Έπειτα από έλεγχο με τη μέθοδο ραδιενεργού θυμιδίνης, δεν παρατηρήθηκε επίδραση των πεπτιδίων στο πολλαπλασιαστικό δυναμικό των PBMCs. Επιπλέον, μετά από χρώση Vybrant Dye Cycle Violet και ανάλυση με FC, δεν διαπιστώθηκε επίδρασή τους στις φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν και in vivo, σε ποντίκια της φυλής C57BL/6, στα οποία χορηγήθηκαν ενδοπεριτοναϊκά PBS (αρνητικός μάρτυρας) και υψηλές δόσεις προΤα, προΤα(100-109) και Τα1. Αναλυτικότερα, δεν παρατηρήθηκαν μορφολογικές αλλοιώσεις στα όργανα (πνεύμονες, ήπαρ, σπλήνας, νεφροί) των πειραματοζώων που έλαβαν τα τρία πεπτίδια, ούτε και διαφοροποιήσεις στο βάρος τους συγκριτικά με την ομάδα του μάρτυρα. Επιπλέον, οι συγκεντρώσεις δεικτών νεφρικής (ουρία, κρεατινίνη) και ηπατικής (SGPT, SGOT) λειτουργίας των εν λόγω πειραματοζώων, παρέμειναν στα επίπεδα της ομάδας του μάρτυρα. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η προΤα και το προΤα(100-109) έχουν αντικαρκινική θεραπευτική αποτελεσματικότητα, καθώς επάγουν Τh1-τύπου ανοσολογικές αποκρίσεις in vivo, ενώ παρουσιάζουν και εξαιρετικό προφίλ ασφαλείας, καθώς δεν προκαλούν τοξικότητα in vitro και in vivo.Προκειμένου να μελετήσουμε το προβλεπτικό δυναμικό του προΤα(100-109), χρησιμοποιήσαμε τη μέθοδο ποσοτικού προσδιορισμού του, την in-house ανταγωνιστικού τύπου ELISA, με τη χρήση αντι-προΤα IgG πολυκλωνικών αντισωμάτων κουνελιού. Το μέγιστο εύρος μέτρησης που επετεύχθη μετά από μελέτη πρότυπων καμπυλών είναι 0,1 ng/mL – 10 μg/mL. Έπειτα καθορίσαμε τις φυσιολογικές τιμές συγκέντρωσης του πεπτιδίου στο πλάσμα του υγιούς πληθυσμού. Αναλύθηκαν συνολικά 523 δείγματα πλάσματος υγιών δοτών (226 άνδρες και 297 γυναίκες), ηλικιακού εύρους 0 – 96 ετών. Ο μέση συγκέντρωση του προΤα(100-109) στο σύνολο του πληθυσμού είναι ιδιαίτερα χαμηλή, 0,508 ng/mL, και ανεξάρτητη του φύλου και της ηλικίας. Κατόπιν ελέγξαμε τη συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του προΤα(100-109) και του ποσοστού επαγωγής ICD. Η εν λόγω συσχέτιση μελετήθηκε σε υπερκείμενα καλλιεργειών καρκινικών κυττάρων, τα οποία οδηγήθηκαν σε ICD μετά την επίδραση φαρμακευτικών παραγόντων ή ιοντίζουσας ακτινοβολίας. Σε καρκινικά κύτταρα από συμπαγείς όγκους και από πολλαπλούν μυέλωμα (ΠΜ) τα οποία καλλιεργήθηκαν παρουσία δοξορουβικίνης και του αναστολέα πρωτεασώματος βορτεζομίμπη (ΒΤΖ), αντίστοιχα, είτε εκτέθηκαν σε γ-ακτινοβολία, παρατηρήσαμε ταυτόχρονη αύξηση των επιπέδων του πεπτιδίου προΤα(100-109) και του ποσοστού των πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων, αυξανομένης της συγκέντρωσης των φαρμακευτικών παραγόντων ή της δόσης της ακτινοβολίας. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός της συγκέντρωσης του προΤα(100-109) στο πλάσμα 11 ασθενών με ΠΜ, πριν και 24 ώρες μετά τη θεραπεία με ΒΤΖ. Σε 6 από τους 11 ασθενείς, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση, σε 4 ασθενείς τα επίπεδα παρέμειναν σταθερά, ενώ σε έναν μόνο σημειώθηκε μείωση. Παράλληλα, διενεργήσαμε κινητική μελέτη σε 4 διαφορετικούς ασθενείς με ΠΜ, στους οποίους προσδιορίστηκε η συγκέντρωση του πεπτιδίου πριν και 6, 12, 24 και 48 ώρες μετά τη θεραπεία με BTZ. Με βάσει τα αποτελέσματα, επιβεβαιώθηκε ως βέλτιστο χρονικό σημείο ποσοτικού προσδιορισμού του προΤα(100-109) το διάστημα μεταξύ 24 και 48 ωρών μετά τη θεραπεία, ενώ παρατηρήθηκε και συσχέτιση μεταξύ της αύξησης των επιπέδων του πεπτιδίου και της απαντητικότητας των ασθενών στη θεραπεία. Στα πλαίσια των in vitro πειραμάτων μας, καλλιεργήσαμε κύτταρα μυελωματικών σειρών με τον φαρμακευτικό παράγοντα Belantamab mafodotin (BMF), ένα σύζευγμα του Belantamab, μονοκλωνικού αντισώματος ειδικού για το αντιγόνο ωρίμανσης των Β λεμφοκυττάρων (BCMA), και της τοξίνης MMAF, που, βάσει μελετών, αποτελεί έμμεσο επαγωγέα ICD. Αφού με FC ελέγξαμε την έκφραση του BCMA στα κύτταρα Η929 και L363 (τα H929 εκφράζουν εντονότερα το BCMA από τα L363), μέσω της δοκιμασίας ΜΤΤ διαπιστώσαμε ότι τα πρώτα είναι και περισσότερο ευαίσθητα σε λύση από το BMF. Παράλληλα, παρατηρήσαμε αύξηση των ποσοστών πρώιμης και όψιμης απόπτωσης στα κύτταρα H929 και L262 όταν καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες παρουσία BMF, με ταυτόχρονη αύξηση των επιπέδων έκφρασης της CRT, μορίου που αποτελεί δείκτη των αρχικών σταδίων επαγωγής ICD, του δείκτη όψιμων σταδίων απόπτωσης HMGB1 και των επιπέδων προΤα(100-109). Η επίδραση του BMF μελετήθηκε και σε ασθενείς με ΠΜ, όπου με FC και πολυχρωματική χρώση προσδιορίσαμε το ποσοστό κυκλοφορούντων κλωνικών πλασματοκυττάρων (ΚΚΠ) πριν και 24 ώρες μετά τη θεραπεία, για 2 κύκλους θεραπείας με μεσοδιάστημα 2 μηνών. Παρατηρήθηκε σημαντική μείωση του ποσοστού των ΚΚΠ μετά τον 1ο κύκλο θεραπείας, ενώ μετά τον 2ο κύκλο θεραπείας δεν ανιχνεύονταν πλέον ΚΚΠ στο αίμα των ασθενών. Παράλληλα επιβεβαιώσαμε και την ειδικότητα του φαρμάκου έναντι του πληθυσμού των Β λεμφοκυττάρων, μελετώντας την επίδραση του BMF στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος (Β και Τ λεμφοκύτταρα, μονοκύτταρα, ουδετερόφιλα και ΝΚ κύτταρα) των ίδιων ασθενών κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Καθώς το BMF λειτουργεί ως επαγωγέας ICD, στους ασθενείς προσδιορίστηκαν και τα επίπεδα έκφρασης της CRT και της συγκέντρωσης των προΤα(100-109) και HMGB1. Διαπιστώθηκε ότι οι μέσοι όροι συγκεντρώσεων των DAMPs προΤα(100-109) και HMGB1 στους ασθενείς αυξήθηκαν 24 ώρες μετά τον πρώτο κύκλο θεραπείας και μάλιστα στους ασθενείς που σημείωσαν πολύ καλή μερική ανταπόκριση (VGPR), τα επίπεδα ήταν υψηλότερα συγκριτικά με εκείνα των ασθενών που σημείωσαν μερική ανταπόκριση (PR) στη θεραπεία. Τέλος, με ανάλυση κυρίων συνιστωσών συσχετίστηκαν τα επίπεδα προΤα(100-109) και HMGB1 με την τρίμηνη ανταπόκριση των ασθενών στη θεραπεία, με την ανάλυση να υποδεικνύει ότι ο προσδιορισμός των επιπέδων ICD μετά τον πρώτο κύκλο θεραπείας, μας επιτρέπει την πρόβλεψη της απαντητικότητας των ασθενών στη θεραπεία με BMF σε βάθος 3 μηνών. Βάσει των παραπάνω, η επαγωγή ICD από θεραπευτικούς αντικαρκινικούς παράγοντες μπορεί να προσδιοριστεί με τη μέτρηση των καθιερωμένων βιοδεικτών HMGB1 και CRT αλλά και του νέου βιοδείκτη προΤα(100-109), τόσο in vitro, όσο και ex vivo στο περιφερικό αίμα ασθενών με καρκίνο. Ο συνδυασμός της αύξησης των επιπέδων των τριών DAMPs μπορεί να αποτελέσει έναν προβλεπτικό βιοδείκτη έγκαιρης θετικής ανταπόκρισης ογκολογικών ασθενών στη θεραπεία.