Η επίδραση των κατεχολαμινών στο ενδοπλασματικό δίκτυο των επιθηλιακών κυττάρων των σιελογόνων αδένων

Abstract

Sjögren’s syndrome (SS) is an autoimmune disease characterized by chronic inflammation of specific secretory epithelia, such as those of salivary gland epithelial cells (SGEC). IL-6, produced by SGEC of SS patients, is a major regulator of immune-mediated tissue injury and it is induced in several cell types by stressful stimuli, through catecholamines. Catecholamines control the salivary protein secretion by SGEC, through beta-adrenergic stimulation. Endoplasmic reticulum (ER) is the major site involved in synthesis and quality control of proteins destined for secretion. Adrenergic stimulation leads to ER stress in several cell types, while adrenergic-driven synthesis of IL-6 has never been associated with the intermediation of ER stress. The aim of this study was to investigate the effect of adrenergic stimulation on IL-6 production by SGEC, as well as the involvement of ER stress on this stimulation pathway, indicating in parallel functional differences between SGEC derived from SS patients and SGEC from disease controls, through analysis of their proteomic profiling. Primary SGEC cultures were established from labial minor salivary gland biopsies (LMSGEC) by the explant out-growth technique. The beta-adrenergic receptors (β-AR) of LMSGEC were stimulated with epinephrine and the mRNA expression levels of UPR (Unfolded Protein Response) genes were subsequently assessed by qPCR, while the protein levels of molecules related to UPR mechanism were examined by Western blotting. IL-6 mRNA levels and IL-6 secretion in LMSGEC supernatants were measured by qPCR and ELISA respectively. The role of beta-adrenergic stimulation in IL-6 production by LMSGEC was evaluated through siRNA-mediated gene silencing of ADRB1 and ADRB2. The ER stress was ameliorated by TUDCA and siRNA was used for the gene silencing of PERK and ATF4. β-AR and cAMP levels were analyzed in LMSG tissues by immunofluorescence, while ADRB1 and ADRB2 expression was evaluated by qPCR. Beta-adrenergic stimulation induced ER stress on human LMSGEC, as attested by induced expression of GRP78/BiP, PERK and ATF4. Following beta-adrenergic stimulation, IL-6 gene expression was upregulated in LMSGEC of SS patients and controls, while IL-6 secretion was equally acute but remained at higher levels in LMSGEC of SS patients. The amelioration of ER stress, as well as the silencing of PERK/ATF4, showed that ER stress, through PERK/ATF4 pathway, is an intermediate hub between adrenergic stimulation and IL-6 induction in LMSGEC. Of note, in the absence of adrenergic stimulation, steady-state IL-6 secretion was observed in LMSGEC, which was higher in LMSGEC of SS patients. The endogenously enhanced beta-adrenergic signaling and the endogenous ER stress (dilated ER lumen, increased levels of GRP78/BiP) may contribute to the sustained IL-6 production by LMSGEC of SS patients. Finally, the proteomic analysis confirmed the enrichment of biological pathways associated with exocytosis and innate immunity in LMSGEC of SS patients, in parallel with metabolic alterations which are mirrored on mitochondria morphology and function.

Το σύνδρομο Sjögren (σS) είναι ένα αυτοάνοσο νόσημα που χαρακτηρίζεται από τη χρόνια φλεγμονή επιθηλιακών κυττάρων με εκκριτική λειτουργία, όπως τα επιθηλιακά κύτταρα των σιελογόνων αδένων (ΕΚΣΑ). Η IL-6, που παράγεται από τα ΕΚΣΑ ασθενών με σS, αποτελεί βασικό ρυθμιστή της ανοσολογικά επαγόμενης ιστικής βλάβης και επάγεται σε διάφορους κυτταρικούς τύπους από στρεσογόνα ερεθίσματα, μέσω των κατεχολαμινών. Οι κατεχολαμίνες ελέγχουν την έκκριση των σιελικών πρωτεϊνών από τα ΕΚΣΑ, μέσω β-αδρενεργικής διέγερσης. Το ενδοπλασματικό δίκτυο (ΕΔ) αποτελεί την κύρια θέση σύνθεσης και ποιοτικού ελέγχου των πρωτεϊνών που προορίζονται για έκκριση. Η αδρενεργική διέγερση σε κάποιους κυτταρικούς τύπους οδηγεί στο στρες ΕΔ, ενώ η κατευθυνόμενη μέσω αδρενεργικής διέγερσης - σύνθεση IL-6 δεν έχει μέχρι σήμερα συνδεθεί με τη διαμεσολάβηση του στρες ΕΔ. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να διερευνηθεί η επίδραση της αδρενεργικής διέγερσης στην παραγωγή IL-6 από τα ΕΚΣΑ, καθώς και η εμπλοκή του στρες ΕΔ σε αυτό το μονοπάτι διέγερσης, αναδεικνύοντας παράλληλα, μέσω ανάλυσης του πρωτεομικού προφίλ, λειτουργικές διαφορές μεταξύ των ΕΚΣΑ ασθενών με σS και των ΕΚΣΑ των μαρτύρων. Πρωτογενείς καλλιέργειες ΕΚΣΑ αναπτύχθηκαν από βιοψίες επικουρικών σιελογόνων αδένων (ΕΣΑ) κάτω χείλους ασθενών με σS και μαρτύρων, μέσω εξωφυτικής ανάπτυξης. Οι β-αδρενεργικοί υποδοχείς (β-AR) των ΕΚΣΑ διεγέρθηκαν με επινεφρίνη και ακολούθως με qPCR προσδιορίστηκαν τα επίπεδα έκφρασης mRNA γονιδίων της UPR σηματοδότησης (Unfolded Protein Response), καθώς και τα πρωτεϊνικά επίπεδα μορίων του UPR μηχανισμού με Western blotting. Τα επίπεδα mRNA IL-6 και η έκκριση IL-6 στα υπερκείμενα των ΕΚΣΑ μετρήθηκαν μέσω qPCR και ELISA αντίστοιχα. Ο ρόλος του β-αδρενεργικού ερεθισμού στην παραγωγή IL-6 από τα ΕΚΣΑ μελετήθηκε μέσω της γονιδιακής αποσιώπησης των ADRB1 και ADRB2 με siRNA. Ο περιορισμός του στρες ΕΔ πραγματοποιήθηκε μέσω TUDCA και η αποσιώπηση των γονιδίων PERK και ATF4 μέσω siRNA. Τα επίπεδα των β-AR και του cAMP εξετάστηκαν με ανοσοφθορισμό σε ιστούς ΕΣΑ, ενώ η έκφραση των ADRB1 και ADRB2 εξετάστηκε στα ΕΚΣΑ με qPCR. Το ΕΔ και η μορφολογία των μιτοχονδρίων αναλύθηκαν με ηλεκτρονική μικροσκοπία σε ιστούς ΕΣΑ. Μέσω πρωτεομικής ανάλυσης, διερευνήθηκε το πρωτεϊνικό προφίλ των ΕΚΣΑ.Η β-αδρενεργική διέγερση προκάλεσε στρες ΕΔ στα ανθρώπινα ΕΚΣΑ, επάγοντας την έκφραση των GRP78/BiP, PERK και ATF4. Mετά τη β-αδρενεργική διέγερση, η έκφραση του γονιδίου IL-6 αυξήθηκε στα ΕΚΣΑ ασθενών με σS και μαρτύρων, ενώ η έκκριση IL-6 ήταν αντίστοιχα οξεία αλλά σε υψηλότερα επίπεδα στα ΕΚΣΑ των ασθενών με σS. Ο περιορισμός του στρες ΕΔ και η αποσιώπηση των PERK/ATF4 κατέδειξαν ότι το στρες ΕΔ, μέσω του μονοπατιού PERK/ATF4, αποτελεί ενδιάμεσο κόμβο μεταξύ αδρενεργικής διέγερσης και επαγωγής IL-6 στα ΕΚΣΑ. Αξιοσημείωτο είναι ότι απουσία αδρενεργικής διέγερσης, παρατηρήθηκε σταθερή έκκριση IL-6 από τα ΕΚΣΑ, η οποία ήταν υψηλότερη στα ΕΚΣΑ των ασθενών με σS. Η ενδογενώς αυξημένη αδρενεργική σηματοδότηση και το ενδογενές στρες ΕΔ (διεσταλμένος αυλός ΕΔ, αυξημένη GRP78/BiP) ενδεχομένως συμβάλλουν στην παρατεταμένη παραγωγή IL-6 από τα ΕΚΣΑ ασθενών με σS. Τέλος, η πρωτεομική ανάλυση ανέδειξε την ενίσχυση των βιολογικών μονοπατιών που σχετίζονται με την εξωκυττάρωση και τη φυσική ανοσία στα ΕΚΣΑ ασθενών με σS, παράλληλα με μεταβολικές αλλαγές που αντανακλώνται στη μορφολογία και λειτουργία των μιτοχονδρίων.