Η επίδραση της σουμοϋλίωσης στη λειτουργία του μεταγραφικού παράγοντα TFAP2A κατά την κυτταρική απόκριση στην υποξία

Abstract

Deficiency of oxygen availability to cells or tissues is known as hypoxia and often occurs within growing solid tumors. Hypoxia-inducible factors (HIFs) are the main mediators of the cellular response to hypoxia. HIFs interact with chromatin and other transcriptional regulators to induce their target genes. In addition, post-translational modifications such as SUMOylation (the covalent attachment of SUMO proteins to target proteins) provide an additional level of regulation in the formation of protein complexes upon transcription, especially in stress conditions such as hypoxia. Previous results from our laboratory showed that HIF-1 physically interacts with the transcription factor TFAP2A. Furthermore, it was shown that hypoxia leads to deSUMOylation of TFAP2A thus enhancing the transcriptional activity of HIF-1. This thesis dives into the role of TFAP2A in the transcriptional regulation of hypoxia-induced genes and the importance of its SUMOylation/deSUMOylation for both the function of TFAP2A and the response of tumor cells to low oxygen concentrations. Chromatin immunoprecipitation experiments followed by DNA sequencing (ChIP-seq) revealed a subset of hypoxia-induced genes whose promoters were occupied by TFAP2A in close or more distant regions from known hypoxia response elements (HREs). Interestingly, silencing of TFAP2A strongly suppressed the expression of these genes in hypoxia, indicating that TFAP2A is a positive regulator of their transcription. Furthermore, through genetic silencing of TFAP2A using CRISPR in HeLa cells, it was shown that TFAP2A regulates chromatin accessibility by facilitating the stable binding of HIF-1 to the promoters of their common target genes. Immunoprecipitation experiments of forms of TFAP2A with or without the ability to be modified by SUMO2/3 combined with proteomic analysis revealed that the Ku70/Ku80 complex (part of the DNA-PK complex) interacts with the non-SUMOylated form of TFAP2A in hypoxia. Indeed it was shown that the presence of Ku70/Ku80 is essential for efficient expression of the common target genes of TFAP2A and HIF-1. Furthermore, using cell lines stably overexpressing the non-SUMOylated or the SUMO-mimetic form of TFAP2A it was shown that SUMOylation negatively regulates TFAP2A binding to chromatin. In addition to the mechanistic aspect of transcriptional regulation, the role of TFAP2A was also studied in the context of cancer cell response and it was shown that both TFAP2A and its SUMOylation affect cell proliferation, migration, and apoptosis properties of cancer cells in which HIFs are known to be involved. Taken together, our data suggest that optimal expression of a subset of HIF-1 target genes depends on the binding of the non-SUMOylated TFAP2A to transcriptional regulatory elements and its interaction with the Ku70/Ku80 complex. As both TFAP2A and HIF play important roles in cancer initiation and progression, a better understanding of their interaction could lead to new therapeutic approaches in hypoxic tumors.

Η μειωμένη διαθεσιμότητα οξυγόνου χαρακτηρίζεται ως υποξία και εμφανίζεται συχνά στους συμπαγείς όγκους. Οι μεταγραφικοί παράγοντες HIF (Hypoxia Inducible Factors) είναι οι κύριοι μεσολαβητές της απόκρισης στην υποξία. Οι HIF αλληλεπιδρούν με τη χρωματίνη και άλλους ρυθμιστές της μεταγραφής για την επαγωγή των γονιδίων-στόχων τους. Οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις όπως η σουμοϋλίωση αποτελούν ένα επιπλέον επίπεδο ρύθμισης ειδικά σε καταστάσεις στρες όπως είναι η υποξία. Προηγούμενα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας έδειξαν πως ο HIF-1 αλληλεπιδρά φυσικά με το μεταγραφικό παράγοντα TFAP2A. Επιπλέον, δείχθηκε ότι η υποξία οδηγεί στην αποσουμοϋλίωση του TFAP2A ενισχύοντας τη μεταγραφική ενεργότητα του HIF-1. Στην παρούσα διατριβή διερευνήθηκε ο ρόλος του TFAP2A στη μεταγραφική ρύθμιση γονιδίων-στόχων της υποξίας και η σημασία της σουμοϋλίωσης/αποσουμοϋλίωσής του αφενός για τη λειτουργία του TFAP2A και αφετέρου για το μηχανισμό απόκρισης των καρκινικών κυττάρων σε συνθήκες υποξίας. Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης με αλληλούχηση του DNA έδειξαν ότι υπάρχει ένα υποσύνολο γονιδίων που επάγονται από την υποξία και διαθέτουν στον υποκινητή τους θέσεις σύνδεσης για τον TFAP2A. Παράλληλα, η αποσιώπηση του TFAP2A κατέστειλε έντονα την επαγωγή των γονιδίων αυτών στην υποξία, δείχνοντας πως είναι ένας θετικός ρυθμιστής της μεταγραφής τους. Επιπλέον, μέσω γενετικής αποσιώπησης του TFAP2A δείχθηκε ότι ρυθμίζει την προσβασιμότητα της χρωματίνης διευκολύνοντας τη σταθερή σύνδεση του HIF-1 στους υποκινητές των κοινών γονιδίων-στόχων τους. Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης διαφορετικά σουμοϋλιωμένων μορφών του TFAP2A και πρωτεομική ανάλυση αποκάλυψαν ότι το σύμπλοκο Ku70/Ku80 αλληλεπιδρά με τη μη σουμοϋλιωμένη μορφή του TFAP2A. Μάλιστα δείχθηκε πως το σύμπλοκο αυτό είναι απαραίτητο για την αποτελεσματική έκφραση των κοινών γονιδίων-στόχων των TFAP2A και HIF-1. Χρησιμοποιώντας κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν σταθερά τη μη σουμοϋλιωμένη ή τη SUMO-μιμητική μορφή του TFAP2A δείχθηκε ότι η σουμοϋλίωση ρυθμίζει αρνητικά τη σύνδεση του TFAP2A στη χρωματίνη. Ο ρόλος του TFAP2A μελετήθηκε επιπλέον στα πλαίσια της απόκρισης καρκινικών κυττάρων και δείχθηκε ότι τόσο ο TFAP2A όσο και η σουμοϋλίωσή του επηρεάζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση, και την απόπτωση ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων στις οποίες είναι γνωστό ότι εμπλέκονται και οι HIF. Συνολικά τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η βέλτιστη έκφραση ενός υποσυνόλου γονιδίων-στόχων του HIF-1 εξαρτάται από τη σύνδεση του μη σουμοϋλιωμένου TFAP2A σε ρυθμιστικά στοιχεία της μεταγραφής και της αλληλεπίδρασής του με το σύμπλοκο Ku70/Ku80. Καθώς τόσο ο TFAP2A όσο και οι HIF παίζουν σημαντικό ρόλο στην εμφάνιση και εξέλιξη του καρκίνου η καλύτερη κατανόηση της αλληλεπίδρασής τους θα μπορούσε να οδηγήσει σε νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις σε υποξικούς όγκους.