Ιστικός και ποσοτικός προσδιορισμός των TLR2, TLR2/1 και TLR2/6 στην αναγέννηση του ήπατος μετά από ηπατεκτομή 2/3 σε μύες

Abstract

Background: Liver regeneration has been studied during the last years through a 2/3 partial hepatectomy animal model. Toll-Like Receptors (TLRs) and several activating proteins, transcription factors, pro-inflammatory cytokines and bioactive mediators seem to play a key role in activating the immune system response after liver injury. The aim of the present experimental study was to investigate the correlation of TLRs and their connecting molecules with liver regeneration. Methods: Eighty C57BL/6J mice were divided into 8 groups: the first 4 groups underwent partial hepatectomy (LR), whereas the other 4 groups underwent an abdominal incision without hepatectomy (Sh). The sacrifice of one group of each team followed at 12 hours (LR12 and Sh12), 24 hours (LR24 and Sh24), 36 hours (LR36 and Sh36) and 168 (LR168 and Sh168). Histological and immunohistochemical analysis, blood tests and quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) were performed. Results: The qRT-PCR tests indicated significant differences in the levels of all immune response proteins measured between all LR and Sh groups at specific time points following partial hepatectomy. In addition, a progressive increase in the expression of TLRs was observed in the first three groups with a normalization of their expression in the last group. Histological examination of liver specimens using hematoxylin and eosin (H&E) staining revealed regeneration of liver tissue in the LR groups. No inflammatory reaction and fat accumulation were observed in control (Sh) groups. Immunohistochemical analysis revealed increased expression of immune response proteins that indicate hepatocyte activation during liver regeneration in LR groups compared to control ones. Blood count tests of white blood cell count (WBC) and red blood cell count (RBC) – as well as liver function tests were significantly different between LR and Sh groups that were sacrificed at the same time point after surgery. Conclusions: TLRs seemed to play a key role in liver regeneration and could represent an effective therapeutic target in the management of acute or chronic liver failure after partial hepatectomy.

Εισαγωγή: Η αναγεννητική ικανότητα του ήπατος έχει διερευνηθεί τα τελευταία χρόνια μέσω του πειραματικού μοντέλου των 2/3 μερικής ηπατεκτομής χρησιμοποιώντας ζωικά πρότυπα τρωκτικών. Οι ανάλογοι των Toll υποδοχείς - Toll Like Receptors (TLRs), αρκετές πρωτεΐνες ενεργοποίησης, παράγοντες μεταγραφής, προ-φλεγμονώδεις κυτταροκίνες και διάφοροι άλλοι μεσολαβητές φαίνεται να διαδραματίζουν βασικό ρόλο στην ενεργοποίηση της ανοσολογικής απάντησης του οργανισμού μετά την ηπατική βλάβη. Σκοπός της παρούσας ερευνητικής μελέτης ήταν να διερευνήσει τον ρόλο των TLRs και των συνδετικών μορίων τους στην αναγέννηση του ήπατος μετά από μερική 2/3 ηπατεκτομή. Μέθοδοι: Ογδόντα (80) C57BL/6J μύες (ποντίκια) τυχαιοποίηθηκαν σε 8 ομάδες: οι πρώτες 4 ομάδες ζωικών προτύπων υποβλήθηκαν σε μερική ηπατεκτομή (ομάδες LR), ενώ στις υπόλοιπες 4 ομάδες εκτελέστηκε λαπαροτομία και σύγκλειση του κοιλιακού τοιχώματος χωρίς ηπατεκτομή (ομάδες ελέγχου, SH). Τα ζωικά πρότυπα υποβλήθηκαν σε παρακέντηση της καρδιάς, αιμοληψία, ακολούθως ευθανασία και τελικά λήψη του ήπατος στα εξής χρονικά σημεία: στις 12 ώρες (ομάδες LR12 και Sh12), στις 24 ώρες (ομάδες LR24 και Sh24), στις 36 ώρες (ομάδες LR36 και Sh36) και στις 168 ώρες (ομάδες LR168 and Sh168). Τα δείγματα ιστών που ελήφθησαν από τα ζωικά πρότυπα υποβλήθηκαν σε ιστολογική και ανοσοϊστοχημική ανάλυση και διενεργήθηκαν εξετάσεις αίματος καθώς και ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (PCR). Αποτελέσματα: Η qRT-PCR έδειξε σημαντικές διαφορές στα επίπεδα όλων των πρωτεϊνών ανοσοαπόκρισης που μετρήθηκαν μεταξύ όλων των ομάδων LR και Sh σε συγκεκριμένα χρονικά σημεία μετά από μερική ηπατεκτομή. Επιπλέον, μια προοδευτική αύξηση στην έκφραση των TLRs παρατηρήθηκε στις τρεις πρώτες ομάδες με ομαλοποίηση της έκφρασής τους στην τελευταία ομάδα. Η ιστολογική εξέταση των παρασκευασμάτων του ήπατος με χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης (H&E) ανέδειξε αναγέννηση του ηπατικού ιστού στις ομάδες LR. Δεν παρατηρήθηκε φλεγμονώδης αντίδραση και συσσώρευση λίπους στις ομάδες ελέγχου (Sh). Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση ανέδειξε αυξημένη έκφραση πρωτεϊνών ανοσοαπόκρισης που υποδηλώνουν ενεργοποίηση ηπατοκυττάρων κατά την αναγέννηση του ήπατος στις ομάδες LR σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου. Οι εξετάσεις αίματος για τον αριθμό των λευκών αιμοσφαιρίων (WBC) και του αριθμού των ερυθρών αιμοσφαιρίων (RBC) – καθώς και τα τεστ ηπατικής λειτουργίας είχαν στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων LR και Sh που θυσιάστηκαν την ίδια χρονική στιγμή μετά την επέμβαση. Συμπεράσματα: Οι TLRs φαίνεται να διαδραματίζουν βασικό ρόλο στην αναγέννηση του ήπατος και θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύσουν έναν αποτελεσματικό θεραπευτικό στόχο στη διαχείριση της οξείας ή χρόνιας ηπατικής ανεπάρκειας μετά από μερική ηπατεκτομή.