Μελέτη της στόχευσης του συστήματος υαλουρονικού/CD44 στον καρκίνο

Abstract

The present thesis highlights the importance of targeting hyaluronan network in the development of more efficient therapeutic approaches against aggressive cancer (sub)types, such as triple negative breast cancer and gliomas. Breast cancer is characterized by high heterogeneity and can be classified based on the presence or absence of Estrogen Receptor α (ERα), Progesterone Receptor (PgR), and Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2). The majority of breast cancer cases (~70%) express ERα and are associated with good prognosis due to the availability of effective hormonal therapies. On the other hand, breast cancer subtypes that do not express ERα (such as Triple Negative Breast Cancers, ERα-/PgR-/HER2-) are characterized by increased aggressiveness and poor prognosis. Glioma is the most common type of brain tumors in adults, accounting for 78% of brain cancers. The most aggressive form of gliomas is glioblastoma multiforme, which is considered the most prevalent primary brain cancer. Most patients with this disease die within a year of diagnosis despite multimodal treatment, due to the heterogeneity of the disease, its invasive nature, and its ability to resist chemotherapy. Hyaluronan is an unbranched heteropolysaccharide and constitutes one of the most important multifunctional components of the extracellular matrix. Its biosynthesis occurs at the cell membrane by hyaluronan synthase isoenzymes (HAS1, HAS2, and HAS3). Hyaluronan exerts its effects through interactions with cell surface receptors, such as the CD44 glycoprotein. The binding of hyaluronan to CD44 is a critical molecular interaction that regulates various physiological and pathological processes, including cancer. Given the significant role of hyaluronan network (hyaluronan synthases, hyaluronidases, and hyaluronan receptors) in cancer, the present PhD thesis focused on limiting the actions of the network by either hyaluronan biosynthesis inhibition or by preventing its binding to CD44. Previous studies by our research team have shown that the suppression of hyaluronan biosynthesis using 4-methylumbelliferone (4-MU) or salicylate (SA) significantly reduces the growth of metastatic breast cancer cells. To further investigate the underlying molecular mechanisms, the effect of these inhibitors on the production of intracellular ROS and oxidative stress-related factors, such as the transcription factor NRF2 and its target genes, was examined. Additionally, the impact of hyaluronan inhibitors on ribosomal protein S6 (rpS6) was studied. rpS6 is a critical component of the 40S ribosomal subunit and is activated through phosphorylation in response to various mitogens. Phosphorylated (active) rpS6 plays a significant role in ribosome biogenesis and assembly, protein synthesis, cell cycle regulation and proliferation. The results showed that the suppression of hyaluronan biosynthesis (using 4-MU or SA) in metastatic triple-negative breast cancer cells induced intracellular ROS production while affected the subcellular distribution of NRF2 and the expression of its target genes. At the same time, it inhibited the activation of the mTOR signaling pathway and the phosphorylation-activation of rpS6. The observed reduction in rpS6 activation was accompanied by a significant decrease in cancer cell proliferation and growth, as 4-MU treatment induced cell cycle arrest, as demonstrated by FACS analysis and the reduced levels of cyclin D1, a key regulator of cell cycle progression. Exogenously added hyaluronan did not counteract the effect of 4-MU on rpS6 phosphorylation, indicating the crucial role of endogenous hyaluronan. Silencing of the HAS2 gene, which is the primary hyaluronan synthase in metastatic breast cancer cells, led to decreased rpS6 phosphorylation, consistent with the results of hyaluronan biosynthesis inhibition using 4-MU, highlighting the direct correlation between hyaluronan and the biological actions of rpS6.Hyaluronan is also the main glycosaminoglycan of the central nervous system, while CD44 is overexpressed in more than 50% of glioblastoma multiforme cases. The interactions between hyaluronan and CD44 seem to drive the progression of this brain cancer type. In this thesis, we also examined the interaction of hyaluronan with the CD44 receptor and the signaling through EGFR. Initially, novel macrocyclic peptides were synthesized and their binding to the hyaluronan-binding region of CD44 was investigated. Two of these peptides (L4-3 and D4-3) exhibited strong binding affinity to CD44. L4-3 and D4-3 significantly inhibited the adhesion of U251MG glioblastoma cancer cells to hyaluronan substrate and critically affected signaling pathways that regulate the functional properties of U251MG glioblastoma cells. Specifically, the L4-3 peptide enhanced the PMA-induced reduction of EGFR phosphorylation (at the Tyr1068 residue) and decreased the EGF-induced phosphorylation of the AKT protein. In summary, this PhD thesis demonstrates the significant role of the hyaluronan-CD44 axis in cell signaling and the behavior of various cancer types. These findings suggest that targeting hyaluronan biosynthesis and its interactions could contribute to the treatment of different types of cancer, which are characterized by increased biosynthesis and accumulation of hyaluronan.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή αναδεικνύει τη στόχευση του δικτύου του υαλουρονικού οξέος (ή υαλουρονικού) ως μια δυνητική θεραπευτική προσέγγιση έναντι του καρκίνου. Μελετήθηκαν δύο τύποι καρκίνου, ο καρκίνος του μαστού και τα γλοιώματα, οι οποίοι χαρακτηρίζονται από την ύπαρξη υπότυπων υψηλής επιθετικότητας και θνησιμότητας. Ο καρκίνος του μαστού μπορεί να κατηγοριοποιηθεί με βάση την παρουσία ή απουσία του υποδοχέα οιστρογόνων α (Estrogen Receptor α, ERα), του υποδοχέα προγεστερόνης (Progesterone receptor, PgR) και του υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα 2 του ανθρώπου (Human epidermal growth factor receptor 2, HER2). Η πλειοψηφία των περιπτώσεων καρκίνου του μαστού (~70%) εκφράζουν τον ERα και χαρακτηρίζονται από καλή πρόγvωση λόγω της ύπαρξης αποτελεσματικών ορμονικών θεραπειών. Οι υπότυποι καρκίνου του μαστού που δεν εκφράζουν τον ERα (όπως ο triple negative breast cancer, ERα-/PgR-/HER2-) χαρακτηρίζονται από αυξημένη επιθετικότητα και κακή πρόγvωση. Από την άλλη πλευρά, τα γλοιώματα είναι ο πιο διαδεδομένος τύπος εγκεφαλικών όγκων στους ενήλικες, αντιπροσωπεύοντας το 78% των περιπτώσεων. Η πιο επιθετική μορφή γλοιώματος είναι το πολύμορφο γλοιοβλάστωμα, το οποίο θεωρείται ο πιο διαδεδομένος πρωτοπαθής καρκίνος του εγκεφάλου. Οι περισσότεροι ασθενείς με αυτή τη νόσο πεθαίνουν σε λιγότερο από ένα χρόνο από τη διάγνωσή τους, παρά την ύπαρξη πολυτροπικής θεραπείας, εξαιτίας της ετερογένειας της νόσου, της διηθητικότητάς της και της ικανότητάς της να αντιστέκεται στη χημειοθεραπεία.Το υαλουρονικό είναι ένας μη διακλαδισμένος ετεροπολυσακχαρίτης και αποτελεί ένα πολυλειτουργικό συστατικό των εξωκυττάριων χώρων. Η βιοσύνθεσή του πραγματοποιείται στην κυτταρική μεμβράνη από τις συνθάσες του υαλουρονικού (hyaluronan synthases; HAS1, HAS2 και HAS3). Το υαλουρονικό ασκεί τις δράσεις του μέσω της αλληλεπίδρασής του με υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας, όπως είναι η γλυκοπρωτεΐνη CD44. H πρόσδεση του υαλουρονικού στον υποδοχέα CD44 αποτελεί μια κρίσιμη μοριακή αλληλεπίδραση, που ελέγχει διάφορες φυσιολογικές αλλά και παθολογικές διεργασίες συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Δεδομένου του σημαντικού ρόλου που διαδραματίζει το σύστημα του υαλουρονικού (συνθάσες υαλουρονικού, υαλουρονιδάσες και κυτταρικοί υποδοχείς) στον καρκίνο, η παρούσα διδακτορική διατριβή εστίασε στην μελέτη του περιορισμού των δράσεων του συστήματος είτε μέσω μείωσης της βιοσύνθεσης του υαλουρονικού είτε μέσω της παρεμπόδισης της πρόσδεσής του στον υποδοχέα CD44. Προηγούμενες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας έχουν δείξει ότι η καταστολή βιοσύνθεσης του υαλουρονικού με τη χρήση των αναστολέων 4-methylumbelliferone (4-MU) ή σαλικυλικό (salicylate, SA) προκαλεί σημαντική μείωση της ανάπτυξης μεταστατικών καρκινικών κυττάρων μαστού. Προκειμένου να διερευνηθούν περαιτέρω οι υποκείμενοι μοριακοί μηχανισμοί, μελετήθηκε η επίδραση των αναστολέων στην παραγωγή ενδοκυττάριων ROS καθώς και παραγόντων που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες, όπως ο μεταγραφικός παράγοντας NRF2 και αντιοξειδωτικά ένζυμα-στόχοι του. Επιπλέον, μελετήθηκε η επίδραση των αναστολέων βιοσύνθεσης του υαλουρονικού στη ριβοσωμική πρωτεΐνη S6 (ribosomal protein S6, rpS6). Η rpS6 αποτελεί ένα κρίσιμο συστατικό της μικρής υπομονάδας 40S του ριβοσώματος και ενεργοποιείται κατά τη φωσφορυλίωσή της ως απόκριση σε διάφορα μιτογόνα. Η φωσφορυλιωμένη (ενεργή) rpS6 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη βιογένεση και συγκρότηση των ριβοσωμάτων, στην πρωτεϊνοσύνθεση, στον κυτταρικό κύκλο και πολλαπλασιασμό.Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η καταστολή της βιοσύνθεσης υαλουρονικού (με 4-MU ή SA) σε μεταστατικά καρκινικά κύτταρα μαστού επάγει την παραγωγή ενδοκυττάριων ROS ενώ επηρεάζει την υποκυτταρική κατανομή του NRF2 και την έκφραση γονιδίων-στόχων του (NQO1, HO-1, GSR). Ταυτόχρονα, αναστέλλει την ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού mTOR και τη φωσφορυλίωση-ενεργοποίηση της rpS6. Η μείωση της ενεργοποίησης της rpS6 συνοδεύτηκε από σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού και της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων, καθώς η επώαση με 4-MU προκάλεσε στάση του κυτταρικού κύκλου, όπως διαπιστώθηκε από ανάλυση FACS και από τα μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης cyclin D1, η οποία έχει κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της προόδου του κυτταρικού κύκλου. Το εξωγενώς προστιθέμενο υαλουρονικό δεν ανέστειλε τη δράση του 4-MU στη φωσφορυλίωση της rpS6 υποδεικνύοντας τον σημαντικό διακριτό ρόλο του ενδογενούς υαλουρονικού. Επιπλέον, η σίγαση του γονιδίου της HAS2, η οποία αποτελεί την κύρια συνθάση στα μεταστατικά καρκινικά κύτταρα μαστού, οδήγησε σε μειωμένη φωσφορυλίωση της rpS6, σε συμφωνία με τα αποτελέσματα της καταστολής της βιοσύνθεσης του υαλουρονικού με 4-MU, υποδεικνύοντας την άμεση συσχέτιση του υαλουρονικού με τις βιολογικές δράσεις της rpS6.Επιπροσθέτως, το υαλουρονικό είναι η κύρια γλυκοζαμινογλυκάνη του κεντρικού νευρικού συστήματος, ενώ ο CD44 υπερεκφράζεται σε περισσότερες από το 50% των περιπτώσεων πολύμορφου γλοιοβλαστώματος. Οι αλληλεπιδράσεις του υαλουρονικού με τον CD44 εμπλέκονται στην εξέλιξη του συγκεκριμένου τύπου καρκίνου του εγκεφάλου. Στην παρούσα διατριβή εξετάσαμε επίσης την αλληλεπίδραση του υαλουρονικού με τον υποδοχέα CD44 και την σηματοδότηση μέσω του υποδοχέα EGFR. Αρχικά συντέθηκαν νέα μακροκυκλικά πεπτίδια και εξετάσθηκε η πρόσδεσή τους στη περιοχή δέσμευσης του υαλουρονικού στον CD44. Δύο από τα πεπτίδια αυτά (L4-3 και D4-3) μπορούσαν να δεσμευτούν ισχυρά στο CD44. Tα L4-3 και D4-3 κατέστειλαν σημαντικά την προσκόλληση καρκινικών κυττάρων γλοιοβλαστώματος U251MG σε υπόστρωμα υαλουρονικού και επηρέασαν κρίσιμα σηματοδοτικά μονοπάτια που ρυθμίζουν τις λειτουργικές ιδιότητες των κυττάρων γλοιοβλαστώματος U251MG. Συγκεκριμένα, το πεπτίδιο L4-3 ενίσχυσε την επαγόμενη από PMA μείωση της φωσφορυλίωσης του EGFR (στο κατάλοιπο Tyr1068 ) και ελάττωσε την επαγόμενη από EGF φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης AKT. Συνοψίζοντας, η παρoύσα διδακτορική διατριβή καταδεικvύει το σημαντικό ρόλο που διαδραματίζει το σύστημα του υαλουρονικού στην κυτταρική σηματοδότηση και συμπεριφορά διαφόρων τύπων καρκίνου. Τα ευρήματα αυτά οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η στόχευση της σύνθεσης και των αλληλεπιδράσεων του υαλουρονικού θα μπορούσαν να συμβάλουν στη θεραπεία συγκεκριμένων μορφών καρκίνου, οι οποίοι χαρακτηρίζονται από την υψηλή βιoσύνθεση και συσσώρευσή του.