Study of antimicrobial resistance and biofilm-forming potential of food-borne Campylobacter strains

Abstract

Food-borne pathogens remain a persistent global challenge, threatening public health, food safety, and economic stability. Among these, Campylobacter spp., Salmonella spp., and Listeria monocytogenes are particularly concerning due to their ability to persist in food processing environments. This research provides a comprehensive investigation into the occurrence of these pathogens in retail food products, the resistance of food-borne Campylobacter spp. isolates to antimicrobial agents, and the potential of organic acid-based interventions to control their biofilm formation. Initially, 60 samples of chilled raw chicken meat and 40 samples of packaged ready-to-eat (RTE) leafy green salads were collected from Greek retail stores (butchers and supermarkets) and analyzed. Detection of the three major food-borne pathogens, Campylobacter spp., Salmonella spp., and L. monocytogenes was performed according to the International Organization for Standardization (ISO) standard methods. Furthermore, representative hygiene indicators (total aerobic plate count (APC), Enterobacteriaceae, total coliforms, Escherichia coli, and staphylococci) were enumerated. Biochemical verification of typical representative colonies of each pathogen was performed following ISO guidelines. All the Campylobacter isolates from chicken (n = 120) were identified to the species level and further classified using multiplex and repetitive sequence-based polymerase chain reaction (rep-PCR). In raw chicken, Campylobacter spp. were found in 54 samples (90.0%), Salmonella spp. in 9 samples (15.0%), and L. monocytogenes in 35 samples (58.3%), reinforcing concerns about cross-contamination and inadequate microbial control along the food supply chain. No Campylobacter was detected in salads, while Salmonella was present in one sample (2.5%) and L. monocytogenes in three (7.5%). Of the Campylobacter isolates from chicken, 65% were identified as C. jejuni, and 35% as C. coli. Alarmingly, APC exceeded 106 CFU/g in 53.3% of chicken and 95.0% of salad samples, with high populations of other safety indicators in some cases, underscoring the urgent need for improved hygiene practices at both production and retail levels. Recognizing the public health risk posed by these bacteria, this study further explored the susceptibility of some selected Campylobacter spp. isolates to three commonly used antimicrobial agents. To this end, the study compared the antimicrobial effects of benzalkonium chloride (BAC), erythromycin (ERY), and L(+)-lactic acid (LA) on 12 Campylobacter isolates from raw chicken meat (7 C. jejuni and 5 C. coli) under planktonic and biofilm growth monoculture conditions. LA was also tested for its growth inhibitory effects against mixed culture biofilms of Campylobacter. Results revealed that the activity of the agents was highly dependent on the isolate, growth mode (planktonic or biofilm), type of intercellular interactions (monocultures or mixed cultures), and growth medium. BAC exhibited minimum inhibitory concentrations (MICs), minimum bactericidal concentrations (MBCs), and minimum biofilm inhibitory concentrations (MBICs) ranging from 0.5 to 16 μg/mL, while ERY values varied from 0.25 to 1024 μg/mL. LA's MICs, MBCs, and MBICs ranged from 1024 to 4096 μg/mL, with mixed-culture biofilms being more difficult to suppress than monocultures. The intercellular interactions in mixed-culture biofilms significantly influenced both population dynamics and bacterial tolerance to acid exposure. This data gives reference information on the comparative effectiveness of antimicrobial agents to control Campylobacter spp. during various growth modes that may be prevalent in food and clinical environments. Furthermore, the ability of LA to inhibit and eradicate biofilms on food processing model surfaces was investigated for a dual-species biofilm composed of C. jejuni and C. coli. This was formed on polystyrene and stainless steel surfaces under mixed-culture conditions, with chicken juice (CJ) supplementation. The biofilm's resilience against LA treatment was assessed under both microaerophilic and aerobic and carbon dioxide (CO2) enriched conditions. LA at a concentration of 4096 μg/mL inhibited mixed-culture biofilm formation by more than 2 logs (>99%) on both surfaces. However, preformed biofilms (approximately 106-7 CFU/cm²) could not be eradicated, even at concentrations exceeding 5% v/v, indicating their high resistance. Moreover, a metabolomics approach showed that the strains exhibit specific metabolic profiles, which might be associated with their biofilm-forming and resistance behaviors. These findings highlight the critical need for robust, multi-faceted control measures to mitigate the risks posed by food-borne pathogens. While lactic acid presents a promising alternative to synthetic disinfectants, its limitations against established biofilms suggest that its application should be integrated with other antimicrobial strategies for optimal efficacy. Overall, this research contributes to the growing body of knowledge on antimicrobial resistance and biofilm control of food-borne Campylobacter spp. isolates, reinforcing the importance of targeted interventions in ensuring food safety from farm to fork.

Τα τροφιμογενή παθογόνα παραμένουν μια επίμονη παγκόσμια πρόκληση, απειλώντας τη δημόσια υγεία, την ασφάλεια των τροφίμων και την οικονομική σταθερότητα. Μεταξύ αυτών, τα Campylobacter spp., Salmonella spp. και Listeria monocytogenes προκαλούν ιδιαίτερη ανησυχία λόγω της ικανότητάς τους να εμμένουν σε περιβάλλοντα επεξεργασίας τροφίμων. Η παρούσα έρευνα παρέχει μια ολοκληρωμένη διερεύνηση της εμφάνισης αυτών των παθογόνων μικροοργανισμών σε προϊόντα λιανικής πώλησης τροφίμων, της ανθεκτικότητας των απομονωμένων στελεχών Campylobacter spp. που μεταδίδονται μέσω τροφίμων σε αντιμικροβιακούς παράγοντες και της δυνατότητας των παρεμβάσεων με βάση τα οργανικά οξέα για τον έλεγχο του σχηματισμού βιοϋμενίου τους. Αρχικά, συλλέχθηκαν 60 δείγματα ψυγμένου ωμού κρέατος κοτόπουλου και 40 δείγματα συσκευασμένων έτοιμων προς κατανάλωση (RTE) πράσινων φυλλωδών σαλατών, από ελληνικά καταστήματα λιανικής πώλησης (κρεοπωλεία και σούπερ μάρκετ) και αναλύθηκαν. Η ανίχνευση των τριών σημαντικών τροφιμογενών παθογόνων, Campylobacter spp., Salmonella spp. και L. monocytogenes, πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με πρότυπες μεθόδους του Διεθνούς Οργανισμού Τυποποίησης (ISO). Επιπλέον, καταμετρήθηκαν αντιπροσωπευτικοί δείκτες υγιεινής (ολική μεσόφιλη αερόβια μικροχλωρίδα (ΟΜΧ), Enterobacteriaceae, ολικά κολοβακτηρίδια, Escherichia coli και σταφυλόκοκκοι). Η βιοχημική επαλήθευση τυπικών αντιπροσωπευτικών αποικιών κάθε παθογόνου πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του ISO. Όλα τα απομονωμένα στελέχη Campylobacter από κοτόπουλο (n = 120) ταυτοποιήθηκαν σε επίπεδο είδους και ταξινομήθηκαν περαιτέρω με τη χρήση πολλαπλής και με βάση την επαναλαμβανόμενη αλληλουχία αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (rep-PCR). Στο νωπό κοτόπουλο, Campylobacter spp. βρέθηκαν σε 54 δείγματα (90,0%), Salmonella spp. σε 9 δείγματα (15,0%) και L. monocytogenes σε 35 δείγματα (58,3%), ενισχύοντας τις ανησυχίες σχετικά με τη διασταυρούμενη μόλυνση και τον ανεπαρκή μικροβιακό έλεγχο κατά μήκος της αλυσίδας εφοδιασμού τροφίμων. Στις σαλάτες δεν ανιχνεύθηκε κανένα καμπυλοβακτηρίδιο, ενώ η Salmonella ήταν παρούσα σε ένα δείγμα (2,5%) και η L. monocytogenes σε τρία (7,5%). Από τα απομονωμένα καμπυλοβακτηρίδια από κοτόπουλο, το 65% ταυτοποιήθηκε ως C. jejuni και το 35% ως C. coli. Είναι ανησυχητικό ότι το APC ξεπέρασε τα 106 CFU/g στο 53,3% των δειγμάτων κοτόπουλου και στο 95,0% των δειγμάτων σαλάτας, με υψηλούς πληθυσμούς άλλων δεικτών ασφάλειας σε ορισμένες περιπτώσεις, υπογραμμίζοντας την επείγουσα ανάγκη για βελτιωμένες πρακτικές υγιεινής τόσο σε επίπεδο παραγωγής όσο και σε επίπεδο λιανικής πώλησης. Αναγνωρίζοντας τον κίνδυνο για τη δημόσια υγεία που ενέχουν αυτά τα βακτήρια, η παρούσα μελέτη διερεύνησε περαιτέρω την ευαισθησία ορισμένων επιλεγμένων απομονώσεων Campylobacter spp. σε τρεις συνηθισμένους χρησιμοποιούμενους αντιμικροβιακούς παράγοντες. Για τον σκοπό αυτό, συγκρίθηκαν οι αντιμικροβιακές επιδράσεις του χλωριούχου βενζαλκονίου (BAC), της ερυθρομυκίνης (ERY) και του L(+)-γαλακτικού οξέος (LA) σε 12 απομονωμένα Campylobacter από ωμό κρέας κοτόπουλου (7 C. jejuni και 5 C. coli) υπό συνθήκες πλαγκτονικής ανάπτυξης και ανάπτυξης βιοϋμενίου ως μονοκαλλιέργεια. Το LA δοκιμάστηκε επίσης για τις ανασταλτικές επιδράσεις του στην ανάπτυξη έναντι βιοϋμενίων μικτής καλλιέργειας Campylobacter. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η δραστικότητα των παραγόντων εξαρτιόταν σε μεγάλο βαθμό από το απομονωμένο βακτήριο, τον τρόπο ανάπτυξης (πλαγκτονικό ή βιοϋμένιο), τον τύπο των διακυτταρικών αλληλεπιδράσεων (μονοκαλλιέργειες ή μικτές καλλιέργειες) και το μέσο ανάπτυξης. Το BAC παρουσίασε ελάχιστες ανασταλτικές συγκεντρώσεις (MIC), ελάχιστες βακτηριοκτόνες συγκεντρώσεις (MBC) και ελάχιστες ανασταλτικές συγκεντρώσεις βιοϋμενίου (MBIC) που κυμαίνονταν από 0,5 έως 16 μg/mL, ενώ οι τιμές για την ERY κυμαίνονταν από 0,25 έως 1024 μg/mL. Οι MICs, MBCs και MBICs του LA κυμαίνονταν από 1024 έως 4096 μg/mL, με τα βιοϋμένια μικτής καλλιέργειας να καταστέλλονται δυσκολότερα από ό,τι τα βιοϋμένια μονοκαλλιέργειας. Οι διακυτταρικές αλληλεπιδράσεις στα βιοϋμένια μικτής καλλιέργειας επηρέασαν σημαντικά τόσο τη δυναμική του πληθυσμού όσο και την ανοχή των βακτηρίων στην έκθεση σε οξύ. Τα δεδομένα αυτά παρέχουν στοιχεία αναφοράς σχετικά με τη συγκριτική αποτελεσματικότητα των αντιμικροβιακών παραγόντων για τον έλεγχο του Campylobacter spp. κατά τη διάρκεια διαφόρων τρόπων ανάπτυξης που θα μπορούσαν να επικρατήσουν σε τρόφιμα και κλινικά περιβάλλοντα. Επιπλέον, διερευνήθηκε η ικανότητα του LA να αναστέλλει και να εξαλείφει βιοϋμένια σε πρότυπες επιφάνειες επεξεργασίας τροφίμων για ένα βιοϋμένιο δύο ειδών αποτελούμενο από C. jejuni και C. coli. Αυτό σχηματίστηκε σε επιφάνειες πολυστυρενίου και ανοξείδωτου χάλυβα υπό συνθήκες μικτής καλλιέργειας, με προσθήκη εγχύματος κοτόπουλου (CJ). Η ανθεκτικότητα του βιοϋμενίου έναντι της επεξεργασίας με LA αξιολογήθηκε τόσο υπό μικροαερόφιλες όσο και υπό αερόβιες συνθήκες και συνθήκες εμπλουτισμένες με διοξείδιο του άνθρακα (CO2). Το LA σε συγκέντρωση 4096 μg/mL ανέστειλε το σχηματισμό βιοϋμενίου μικτής καλλιέργειας κατά περισσότερο από 2 logs (>99%) και στις δύο επιφάνειες. Ωστόσο, τα προσχηματισμένα βιοϋμένια (περίπου 106-7 CFU/cm²) δεν μπορούσαν να εξαλειφθούν, ακόμη και σε συγκεντρώσεις που υπερέβαιναν το 5% v/v, υποδεικνύοντας την υψηλή αντοχή τους. Επιπλέον, μια μεταβολομική προσέγγιση έδειξε ότι τα στελέχη εμφανίζουν συγκεκριμένα μεταβολικά προφίλ, τα οποία μπορεί να σχετίζονται με τον σχηματισμό βιοϋμενίου και την αντοχή τους. Τα ευρήματα αυτά υπογραμμίζουν την κρίσιμη ανάγκη για ισχυρά, πολύπλευρα μέτρα ελέγχου για τον μετριασμό των κινδύνων που ενέχουν τα τροφιμογενή παθογόνα. Ενώ το γαλακτικό οξύ αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική λύση έναντι των συνθετικών απολυμαντικών, οι περιορισμοί του έναντι των εγκατεστημένων βιοϋμενίων υποδηλώνουν ότι η εφαρμογή του θα πρέπει να ενσωματωθεί με άλλες αντιμικροβιακές στρατηγικές για βέλτιστη αποτελεσματικότητα. Συνολικά, η παρούσα έρευνα συμβάλλει στον αυξανόμενο όγκο γνώσεων σχετικά με την αντιμικροβιακή αντοχή και τον έλεγχο των βιοϋμενίων των απομονωμένων στελεχών Campylobacter spp. που μεταδίδονται μέσω τροφίμων, ενισχύοντας τη σημασία των στοχευμένων παρεμβάσεων για τη διασφάλιση της ασφάλειας των τροφίμων από το αγρόκτημα στο τραπέζι.