Επίδραση του περιβάλλοντος στην ανάπτυξη του σκελετού του είδους Danio rerio (Hamilton 1822) και προσδιορισμός μοριακών δεικτών για την εκτίμηση πιθανών οντογενετικών αποκλίσεων

Abstract

The presence of skeletal deformities in teleosts is one of the most important problems in farmed fish and many of them may occur throughout developmental life, from embryo up to adulthood. Any deviation from normal ontogeny and phenotype can be located by histological and radiographic methods and sometimes later in development by visual observation. However, the most important thing for hatcheries is to detect deformities in early stages and reduce their negative impact. During the last years many studies have been conducted about offspring quality (Koumoundouros 2019). The purpose of this study was to test whether the developmental environment affects offspring’s quality and the development of new embryo quality indices. Furthermore, the relationship between the quality of embryos and that of larvae was also studied. We used zebrafish as an experimental laboratory model and the sea bream as it is a major species of Mediterranean aquaculture. The first experiment examined the effect of adult zebrafish density on embryo quality. Adults’ zebrafish were separated in four densities (3.75, 7.5, 11.25, 18.75 ind./l) and were monitored for their relative fecundity, survival, fertilization, hatching and deformity rate every three days for 40 days. Moreover, deformities in larvae were assessed after hatching. The results show that density is inversely proportional to the relative fecundity. In addition, the survival and fertilization rate were affected by densities of 7.5 and 11.25 ind./L. Deformities (notochord flexion and pericardial edema) were not affected by density. The second experiment investigated the effect of acute stress of adult zebrafish in the progeny development. A broodstock was chased, netted and exposed to air for 1 minute, then separated in 4 tanks with 1:1 male-female ratio. Samples were taken at 0, 0.5, 1 and 2 hours after stress. The results showed that females are more sensitive to acute stress than males. The maximum levels of female body cortisol and gonad cortisol were observed 0.5hour after stress instead of cortisol level before stress (p<0.05, Kruskal – Wallis test) and reached the basal levels at 2 hours after stress. Statistical differences were observed between the samples of 0.5 and 2 hours after stress (p<0.05, Kruskal – Wallis test). The maximum cortisol levels were 14.4 ng/g and 8.9 ng/g tissue for body and gonads respectively. The basal cortisol level were 5.75 ng/g and 1.67 ng/g for body and gonad respectively. The male body cortisol levels did not find any difference. In the third experiment, the purpose was to find if acute stress of broodstock affect zebrafish embryo. As well as if temperature development affected larvae and juveniles. For this experiment two zebrafish broodstocks were used. Acute stress was applied on one broodstock whereas the second broodstock served as control. Fish were bred at 2, 8, days post stress and the eggs obtained were used to measure the costisol and mRNA levels of cyclin B (ccnB1), cathepsin D (cathepsinD) and glycocorticoid receptor (GR) and control genes beta actin (b-actin), ribosomal protein L13a (rpl13a). Τhe selected genes were expressed in early developmental stages, were maternal origin and could be associated with embryo quality. Additionally, measurements of fertility and yolk sac size were also performed. The results indicated that cortisol levels were increased in embryos originating from the control broodstock at 8 dps (days post stress) compared to embryos from stress broodstock at the same time (p<0,05, Mann Whitney U-test). The yolk sac size showed differences only in one experimental repeat. The mRNA level of ccnb1 and GR were increased in embryos from the control broodstock at 8 dps (p<0,05, Kruskal Wallis test). The mRNA levels of cathepsin D in embryos were not affected by broodstock stress status. No stable pattern was observed for fertility. Embryos derived from post stress period 2, 8, 15, 22, 30 days were transferred in aquaria with the water temperature of either 28 or 32 oC until metamorphosis. mRNA levels of osteocalcin, matrix Gla protein (mgp), heat shock 70 kDa protein C (hps70) και glucocorticoid receptor (GR) and b-actin και rpl13a were assessed at hatching, first feeding and metamorphosis stage. The selected genes were maternal origin and necessary for normal development of embryos. The evaluation of deformities took place at metamorphosis. The effect of acute stress of broodstock did not affect the mRNA levels of any gene in any post stress period (2, 8, 15, 22, 30 dps) at developmental temperature 28 oC and 32 oC. mRNA levels of mgp at 32 oC were higher instead of 28 oC at hatching and first feeding stage (p<0,05, Mann Whitney U test). At metamorphosis stage, no differences were found between the developmental temperature of mRNA levels of mgp. The mRNA levels of osteocalcin, mgp and hsp70 at 28 and 32 oC at hatching stage were higher than metamorphosis stage. Moreover, mRNA levels of mgp at 28 oC were higher at first feeding than hatching. The mRNA levels of GR were higher at metamorphosis in relation to hatching at both temperatures (p<0.05, Kruskal Wallis test). The observation of skeletal deformities in larvae at metamorphosis stage revealed pelvic malformations in both temperatures. The deformities referred to short or absent basipterygium. The frequency of skeletal deformities obtained at 2 dps was higher in larvae from control brood stock than stress broodstock in both temperatures In terms of growth, lower SGR was observed at control broodstock than stress, for individuals obtained at 2 dps at 32 oC. The effect of developmental temperature at cortisol level of embryo and larvae were studied at 8 dps to the control group between the ontogenetic stages. The results revealed the cortisol levels of embryos were decreased that cortisol levels at hatching at developmental temperature 28oC (p<0,05, Kruskal – Wallis test). The comparison of cortisol levels between developmental temperature at the same stage did not reveal any differences (p>0,05, Mann Whitney U-test). The fourth experiment assessed the development of eggs and embryos in different reproductive periods and the relation between the quality of larvae and embryos of seabream. For the purposes of this experiment three seabream broodstocks were used that reached adulthood in three different maturation periods early, late or natural, under controlled conditions of temperature and photoperiods. The factors under examination were quantity of spawned eggs, floating eggs (benthic, not viable, Divanach 1985), unfertilized eggs and malformed embryos up to 150 days after the onset of spawning. The results revealed that the quantity of eggs at late and natural developmental period decreased up to 100 days after the onset of spawning. In the early developmental period, the quantity fluctuated throughout the developmental period. Concerning the experiment assessing the quality of embryos and larvae, six broodstock with high quality of progeny and six with low quality were utilized. The quality control of embryos was based on unfertilized eggs and abnormal embryos. The cortisol levels, early maternal genes and deformities of larvae originating from the two broodstock were evaluated (high and low embryo quality). The results demonstrated that mRNA levels of cyclin A and GR were higher in high embryo quality compared to those of the low quality embryos (p<0.05, Kruskal – Wallis test). The mRNA levels of cathepsin D, cathespin Z were not found any differences between the two embryo quality. The cortisol levels and frequency of deformities were not found any differences between high and low embryo quality.

Οι σκελετικές παραμορφώσεις των τελεόστεων ιχθύων αποτελούν ίσως το πιο σημαντικό πρόβλημα στις μονάδες ιχθυοκαλλιεργειών με πολλές μορφο-ανατομικές ανωμαλίες να ακολουθούν τα ψάρια σε όλη τη διάρκεια της ανάπτυξης τους, από το εμβρυϊκό στάδιο μέχρι και την πλήρη ανάπτυξη του ατόμου. Οποιαδήποτε απόκλιση από τη φυσιολογική οντογένεση και φαινότυπο μπορεί να εντοπιστεί εύκολα με ιστολογικές και ραδιογραφικές μεθόδους και κάποιες φορές οι παραμορφώσεις είναι οπτικά εμφανείς στα μετέπειτα στάδια. Παρ ’όλα αυτά, στόχος είναι να περιοριστούν οι παραμορφώσεις από τα πρώιμα στάδια ανάπτυξης ώστε να μειωθούν οι απώλειες σε όλους τους τομείς για τις μονάδες ιχθυοκαλλιεργειών. Τα τελευταία χρόνια η έρευνα έχει επεκταθεί στον προσδιορισμό πρώιμων δεικτών ποιότητας των καλλιεργούμενων ειδών (Koumoundouros 2019). Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η έρευνα της επίδρασης του περιβάλλοντος ανάπτυξης στην ποιότητα των απογόνων και η εύρεση δεικτών ποιότητας σε έμβρυα. Επίσης μελετήθηκε η σχέση της ποιότητας των εμβρύων με αυτή των νυμφών. Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν δυο είδη, το zebrafish το οποίο είναι εργαστηριακό μοντέλο και η τσιπούρα που αποτελεί ένα από τα πιο σημαντικά καλλιεργούμενα είδη της Μεσογείου. Το πρώτο πείραμα αφορούσε στην επίδραση της πληθυσμιακής πυκνότητας των ενήλικων zebrafish στην ποιότητα των εμβρύων. Ενήλικα άτομα zebrafish εκτέθηκαν σε τέσσερις πυκνότητες (3,75, 7,5, 11,25 και 18,75 άτομα/λίτρο) και ελέγχθηκαν χαρακτηριστικά στα αυγά που απελευθέρωναν οι παραπάνω πειραματικοί πληθυσμοί (3,75, 7,5, 11,25 και 18,75 άτομα/λίτρο), όπως η σχετική γονιμότητα, ρυθμός επιβίωσης και γονιμοποίησης, ρυθμός εκκόλαψης και συχνότητα παραμορφώσεων πριν και μετά την εκκόλαψη κάθε τρεις ημέρες για 40 ημέρες. Επίσης, μετά την εκκόλαψη έγινε έλεγχος του είδους των ανωμαλιών που εμφανίστηκαν στις νύμφες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όσο αυξάνεται η πληθυσμιακή πυκνότητα τόσο μειώνεται η σχετική γονιμότητα (p<0.05, Kruskal Wallis test). Επιπλέον, ο ρυθμός επιβίωσης και γονιμοποίησης στην πληθυσμιακή πυκνότητα 7,5 άτομα/ λίτρο είναι σημαντικά μεγαλύτερος από την πληθυσμιακή πυκνότητα 11,25 άτομα/λίτρο (p<0.05, Kruskal – Wallis test). Όσον αφορά στις παραμορφώσεις (κυρίως κάμψεις της νωτοχορδής και περικαρδιακό οίδημα) των νυμφών δεν βρέθηκαν να επηρεάζονται σημαντικά. Το δεύτερο πείραμα που πραγματοποιήθηκε αφορούσε στην επίδραση της οξείας καταπόνησης των ενηλίκων zebrafish στα επίπεδα κορτιζόλης. Σε ένα απόθεμα γεννητόρων εφαρμόστηκε κυνήγι και κράτημα των ατόμων εκτός νερού για 1 λεπτό, στη συνέχεια χωρίστηκαν τα άτομα σε 4 διαφορετικά ενυδρεία. Κάθε ενυδρείο αντιστοιχούσε στη χρονική στιγμή (0, 0,5, 1, 2 ώρες μετά την καταπόνηση) που παίρνονταν τα δείγματα για μέτρηση των επιπέδων κορτιζόλης στο σώμα των θηλυκών ατόμων και των γονάδων αλλά και των αρσενικών ατόμων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τόσο στο σώμα των θηλυκών ατόμων, όσο και στις ωοθήκες, τα επίπεδα της κορτιζόλης μεγιστοποιούνται στη μισή ώρα μετά την καταπόνηση συγκριτικά με τα επίπεδα πριν την καταπόνηση (p<0.05, Kruskal – Wallis test). Σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν μεταξύ των δειγμάτων της μισής ώρα και των δυο ωρών όπου τα επίπεδα κορτιζόλης έφτασαν σε τιμές βάσης (p<0.05, Kruskal – Wallis test). Το μέγιστο της συγκέντρωσης κορτιζόλης εκτιμήθηκε στα 14,4 ng/g και 8,9 ng/g ιστού για την περίπτωση του σώματος και των ωοθηκών αντίστοιχα. Τα επίπεδα βάσης (συγκέντρωση κορτιζόλης πριν την καταπόνηση), αυτά εκτιμήθηκαν σε 5,75 ng/g και 1,67 ng/g για την περίπτωση του σώματος και των γονάδων αντίστοιχα. Τέλος τα αρσενικά δεν εμφάνισαν καμία απόκριση στην οξεία καταπόνηση. Στο τρίτο πείραμα στόχος ήταν να βρεθεί αν και κατά πόσο η οξεία καταπόνηση των γεννητόρων επηρεάζει τα έμβρυα του zebrafish. Όπως επίσης αν η θερμοκρασία ανάπτυξης επηρεάζει τις νύμφες και τα ιχθυδια. Για την πραγματοποίηση του πειράματος αυτού χρησιμοποιήθηκαν δύο αποθέματα γεννητόρων Στο ένα είχε εφαρμοστεί οξεία καταπόνηση και το άλλο χρησιμοποιήθηκε ως πληθυσμός ελέγχου. Τόσο από τον καταπονημένο πληθυσμό όσο και από τον πληθυσμό ελέγχου γινόταν τυχαία λήψη από διαδοχικές ωοτοκίες για έλεγχο των επιπέδων κορτιζόλης κάθε 2, 8 ημέρες μετά την καταπόνηση και των επιπέδων mRNA των γονιδίων cyclin B (ccnB1), cathepsin D (cathepsinD) και glycocorticoid receptor (GR) και γονίδια ελέγχου beta actin (b-actin), ribosomal protein L13a (rpl13a). Η μέτρηση των επιπέδων της γονιδιακής έκφραση επιλέχτηκε να γίνει σε γονίδια που εκφράζονται σε πρώιμα στάδια ανάπτυξης του εμβρύου, είναι μητρικής προέλευσης και θα μπορούσαν να σχετίζονται με την ποιότητα των εμβρύων. Επίσης γινόταν μέτρηση της μέγιστης διαμέτρου της λεκίθου του εμβρύου αλλά και μέτρηση της εξέλιξη της γονιμότητας του πληθυσμού των γεννητόρων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα κορτιζόλης ανά έμβρυο ήταν μεγαλύτερα στα έμβρυα που προέρχονται από μη καταπονημένους γεννήτορες σε σύγκριση με τα επίπεδα κορτιζόλης ανά έμβρυο από τους καταπονημένους γεννήτορες, στις 8 ημέρες μετά την καταπόνηση (p<0,05, Mann Whitney U-test). Το μέγεθος της λεκίθου του εμβρύου εμφάνισε στατιστικά σημαντικές διαφορές μόνο στη μια πειραματική επανάληψη. Όσο αφορά στα επίπεδα mRNA των ccnB1 και GR βρέθηκαν να είναι σημαντικά μικρότερα στα έμβρυα που οι γεννήτορες είχαν υποστεί καταπόνηση στις 8 ημκ (p<0,05, Kruskal Wallis test). Τα επίπεδα mRNA της cathepsin D στα έμβρυα δεν φάνηκε να επηρεάστηκαν από την καταπόνηση των γεννητόρων. Επίσης, η εξέλιξη της γονιμότητας δεν φάνηκε να ακολουθεί κάποιο σταθερό πρότυπο. Για τον έλεγχο της θερμοκρασίας ανάπτυξης στις νύμφες και τα ιχθύδια κάθε 2, 8, 15, 22, 30 ημέρες μετά την καταπόνηση και στους δυο πληθυσμούς (καταπόνησης και ελέγχου), έμβρυα τοποθετούνταν σε ενυδρεία με θερμοκρασίες 28 και 32 oC και εκτρέφονταν μέχρι το στάδιο της μεταμόρφωσης. Για τον έλεγχο των επιπέδων mRNA των osteocalcin, matrix Gla protein (mgp), heat shock 70 kDa protein C (hsp70) και glucocorticoid receptor (GR) και γονίδια ελέγχου b-actin και rpl13a παίρνονταν δείγματα στο στάδιο της εκκόλαψης, έναρξης διατροφής και μεταμόρφωσης. Τα παραπάνω γονίδια επιλέχθηκαν για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης τους γιατί είναι μητρικής προέλευσης και απαραίτητα για την φυσιολογική ανάπτυξη του zebrafish. Όσο για τον έλεγχο των παραμορφώσεων οι δειγματοληψίες γίνονταν στο στάδιο της μεταμόρφωσης. Η οξεία καταπόνηση των γεννητόρων δεν επέδρασε σημαντικά στα επίπεδα έκφρασης κανενός από τα εξεταζόμενα γονίδια, σε καμία χρονική στιγμή μετά την καταπόνηση (2, 8, 15, 22, 30 ημκ) τόσο στους 28, όσο και στους 32 οC θερμοκρασία ανάπτυξης. Όσον αφορά τη θερμοκρασιακή επίδραση παρατηρήθηκαν μεγαλύτερα επίπεδα έκφρασης της mgp στη θερμοκρασία των 32 οC συγκριτικά με τους 28 οC, τόσο στο στάδιο της εκκόλαψης όσο και στην έναρξη της διατροφής (p<0,05, Mann Whitney U test). Στο στάδιο της μεταμόρφωσης δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές των επιπέδων mRNA της mgp μεταξύ των θερμοκρασιών. Από τη σύγκριση των επιπέδων mRNA των εξεταζόμενων γονιδίων μεταξύ των οντογενετικών σταδίων βρέθηκε ότι τα επίπεδα mRNA των osteocalcin, mgp και hsp70 στους 28 και 32 οC, στο στάδιο της εκκόλαψης ήταν σημαντικά μειωμένα από ότι στο στάδιο της μεταμόρφωση. Επίσης, τα επίπεδα mRNA της mgp στους 28 οC ήταν αυξημένα στην έναρξη της διατροφής από ότι στην εκκόλαψη. Τέλος, τα επίπεδα mRNA της GR στις δυο εξεταζόμενες θερμοκρασίες βρέθηκαν αυξημένα στη μεταμόρφωση από ότι στο στάδιο της εκκόλαψης (p<0.05, Kruskal Wallis test). Ως προς τις σκελετικές παραμορφώσεις των νυμφών στο στάδιο της μεταμόρφωσης αποκαλύφθηκε ότι τα κοιλιακά πτερύγια επηρεάζονται από την καταπόνηση των γεννητόρων και στις δυο θερμοκρασίες. Οι παραμορφώσεις που παρατηρήθηκαν ήταν έλλειψη ή κοντά βασιπτερύγια. Η συχνότητα εμφάνισης των συγκεκριμένων παραμορφώσεων στις 2 ημέρες μετά την καταπόνηση (2ημκ) ήταν μεγαλύτερη στις νύμφες που δεν είχαν υποστεί καταπόνηση οι γεννήτορες. Όσο αφορά στο ρυθμό αύξησης των νυμφών, οι διαφορές εντοπίστηκαν στις 2ημκ στους 32 oC με μειωμένο ρυθμό στους πληθυσμούς των μη καταπονημένων γεννητόρων. Τέλος, η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στα επίπεδα κορτιζόλης των εμβρύων και νυμφών μεταξύ των οντογενετικών σταδίων μελετήθηκε στις 8 ημέρες μετά την καταπόνηση (8ημκ) στον μη καταπονημένο πληθυσμό. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων αποκάλυψαν σημαντική μείωση των επιπέδων κορτιζόλης από τα έμβρυα στο στάδιο της εκκόλαψης των ατόμων τα οποία είχαν αναπτυχθεί στους 32 oC. Επίσης, σημαντική μείωση παρατηρήθηκε από το στάδιο του εμβρύου στο στάδιο της μεταμόρφωσης των ατόμων τα οποία είχαν αναπτυχθεί στους 28oC (p<0,05, Kruskal – Wallis test). Η κατά ζεύγη σύγκριση των επιπέδων κορτιζόλης μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιών στο ίδιο στάδιο ανάπτυξης, δεν έδειξε σημαντικές διαφορές (p>0,05, Mann Whitney U-test). Το τέταρτο πείραμα αφορούσε στην εξέλιξη της ποιότητας των ωαρίων και των εμβρύων στην τσιπούρα σε τρεις αναπαραγωγικές περιόδους αλλά και στον έλεγχο της ποιότητας των νυμφών σε σχέση με τη ποιότητα των εμβρύων. Για τα πειράματα της εξέλιξη της ποιότητας χρησιμοποιήθηκαν τρία αποθέματα γεννητόρων που ωρίμασαν σε τρεις διαφορετικές χρονικές περιόδους (πρώιμη, όψιμη και φυσική) υπό ελεγχόμενες συνθήκες φωτοπεριόδου και θερμοκρασίας. Οι παράγοντες που εξετάστηκαν ήταν η ποσότητα των παραγόμενων αυγών, το ποσοστό των μη επιπλεόντων αυγών (βενθικών, μη βιώσιμων, Divanach 1985), των αγονιμοποίητων αυγών, καθώς και το ποσοστό των εμβρύων με εμφανείς μορφολογικές ανωμαλίες, υπολογισμένο επί των επιπλεόντων αυγών. Η συλλογή δεδομένων διήρκησε 150 μέρες μετά την έναρξη της αναπαραγωγής. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ποσότητα των παραγόμενων αυγών στην όψιμη και φυσική αναπαραγωγική περίοδο μειώνονταν με την πάροδο του χρόνου μέχρι τις 100 ημέρες μετά την έναρξη της αναπαραγωγής. Από την άλλη, στην πρώιμη αναπαραγωγική περίοδο η ημερήσια ποσότητα των παραγόμενων αυγών παρουσίασε διακύμανση καθ’ όλη τη διάρκεια της αναπαραγωγικής περιόδου. Για τα πειράματα ελέγχου της ποιότητας των νυμφών σε σχέση με την ποιότητα των εμβρύων επιλέχθηκαν έξι πληθυσμοί εμβρύων υψηλής ποιότητας και έξι χαμηλής από πληθυσμό γεννητόρων που ωρίμαζε υπό φυσικές συνθήκες φωτοπεριόδου. Ο έλεγχος της ποιότητας των εμβρύων έγινε με βάση το ποσοστό αγονιμοποίητων αυγών, καθώς και των γονιμοποιημένων με μορφολογικές ανωμαλίες. Στις δύο ποιότητες (χαμηλή και υψηλή) εμβρύων ελέγχθηκαν τα επίπεδα κορτιζόλης και έκφρασης γονιδίων μητρικής προέλευσης, καθώς και οι σκελετικές παραμορφώσεις των νυμφών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η τα επίπεδα mRNA της cyclin A και glucocorticoid receptor ήταν υψηλά στα υψηλής ποιότητας έμβρυα έναντι της χαμηλής ποιότητας (p<0.05, Kruskal – Wallis test). Στα υπόλοιπα εξεταζόμενα γονίδια (cathepsin D και cathespin Z) δεν βρέθηκαν διαφορές μεταξύ των δυο ποιοτήτων των εμβρύων. Όσο αφορά τα επίπεδα κορτιζόλης και τη συχνότητα εμφάνισης παραμορφώσεων, δεν βρέθηκαν διαφορές μεταξύ της υψηλής και χαμηλής ποιότητας των εμβρύων.