Ένας νέος μηχανοευαίσθητος μηχανισμός επάγει τον σχηματισμό συσσωματωμάτων ακτίνης κι εμποδίζει τη θραύση γεφυρών χρωματίνης στην κυτταροκίνηση

Abstract

In the presence of chromatin bridges in cytokinesis, human cells retain actin-rich structures, called “actin patches”, at the base of the intercellular canal to prevent chromosome breakage. In this study, we showed that the small GTPase RhoA and its downstream effectors ROCK, LIMK, Cofilin and mDia1, which are implicated in actin remodeling, localize to actin patches. Inhibition of RhoA, ROCK, LIMK or mDia1 using siRNAs or small molecule inhibitors impairs formation of actin patches and correlates with chromatin bridge breakage in cytokinesis compared with controls. In contrast, expression of constitutively active ROCK or phosphomimetic LIMK in RhoA-deficient cells, rescues actin patches and prevents chromatin bridge breakage. Simultaneous inhibition of mDia1 and ROCK or mDia1 and LIMK increases the frequency of broken chromatin bridges compared with single-deficient cells. Also, the RhoA-activator PDZ RhoGEF localizes at actin patches in control cells. Inhibition of PDZ diminishes RhoA localization at the base of the intercellular canal, impairs actin patch formation and promotes chromatin bridge breakage. However, expression of constitutively active RhoA in PDZ-deficient cells, rescues actin patches and prevents chromatin bridge breakage. We also showed that daughter nuclei in control cells with intact bridges are under mechanical (“nuclear”) tension, as judged by changes to nuclear shape and nuclear membrane morphology, and that the SUN1/2 – Nesprin 2 LINC complex accumulates near the base of chromatin bridges. Depletion of SUN1/2 or Nesprin 2, but not RhoA, diminishes nuclear deformation, prevents accumulation of LINC proteins at the base of chromatin bridges and promotes the generation of tensionless “loose” chromatin bridges. Furthermore, inhibition of LINC complex prevents actin patch formation and promotes chromatin bridge breakage, indicating a previously unidentified link between nuclear tension, the LINC complex and actin patch formation. Using mutant Nesprin 2 proteins in siRNA depletion-replacement experiments, we showed that interaction of Nesprin 2 with the actin cytoskeleton and nuclear lamina promotes nuclear tension and accumulation of LINC proteins at the base of chromatin bridges. Furthermore, we showed that the cytoplasmic Nesprin 2 spectrin repeats (SRs) are required for actin patch formation and that SRs bind to PDZ RhoGEF in cell extracts and in vitro. Targeting RhoA at the base of chromatin bridges, by expressing mutant Nesprin 2 proteins fused to SRs or to the DHPH domain of PDZ RhoGEF that interacts with RhoA, rescues actin patches and prevents chromatin bridge breakage in Nesprin 2–deficient cells. Also, mislocalization of Nesprin 2 into nuclear granules by overexpression of Lamin A prevents actin patch formation and correlates with formation of actin foci that colocalize with Nesprin 2. On the basis of the above findings, we propose that, in cytokinesis with chromatin bridges, the LINC complex is required for generation of nuclear tension. This tension promotes SUN1/2 and Nesprin 2 accumulation at the base of chromatin bridges and local enrichment of PDZ RhoGEF, through PDZ binding to the cytoplasmic Nesprin 2 spectrin repeats. In turn, PDZ RhoGEF activates RhoA and downstream RhoA - ROCK – LIMK – Cofilin and RhoA - mDia1 signaling to promote actin patch formation and prevent chromatin bridge breakage in cytokinesis. These results identify a novel mechanosensitive mechanism by which cells with chromatin bridges convert mechanical signal to biochemical signaling, through tension-induced activation of a LINC – PDZ – RhoA molecular pathway, to promote actin patch formation and maintain genome integrity.

Παρουσία γεφυρών χρωματίνης στην κυτταροκίνηση, τα κύτταρα του ανθρώπου σχηματίζουν δομές πολυμερισμένης ακτίνης, που ονομάζονται «συσσωματώματα ακτίνης», στη βάση του κυτταροπλασματικού καναλιού, για να εμποδίσουν το σπάσιμο των χρωμοσωμάτων. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε ότι η μικρή GTPάση RhoA και οι καθοδικές της πρωτεΐνες ROCK, LIMK, Cofilin και mDia1, οι οποίες εμπλέκονται στην αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού ακτίνης, εντοπίζονται στα συσσωματώματα ακτίνης. Μείωση ή αναστολή των RhoA, ROCK, LIMK και mDia1 με siRNA ή χημικούς αναστολείς εμποδίζει τον σχηματισμό συσσωματωμάτων ακτίνης και προκαλεί σπάσιμο των γεφυρών χρωματίνης στην κυτταροκίνηση, σε σύγκριση με αγρίου τύπου κύτταρα. Αντίθετα, έκφραση της συνεχώς ενεργοποιημένης ROCK ή φωσφομιμητικής LIMK, σε κύτταρα με μειωμένη RhoA, επαναφέρει τα συσσωματώματα ακτίνης κι εμποδίζει τη θραύση των γεφυρών χρωματίνης. Ταυτόχρονη αναστολή των mDia1 και ROCK ή mDia1 και LIMK αυξάνει τις σπασμένες γέφυρες χρωματίνης, σε σύγκριση με κύτταρα που επωάστηκαν με αναστολέα μόνο για την μία πρωτεΐνη. Επίσης, η PDZ RhoGEF, πρωτεΐνη που ενεργοποιεί την RhoA, εντοπίζεται στα συσσωματώματα ακτίνης σε κύτταρα ελέγχου. Αναστολή της PDZ ελαττώνει τον εντοπισμό της RhoA στη βάση του κυτταροπλασματικού καναλιού, μειώνει την ένταση φθορισμού των συσσωματωμάτων ακτίνης κι επάγει το σπάσιμο των γεφυρών χρωματίνης. Αντίθετα, έκφραση της συνεχώς ενεργοποιημένης RhoΑ επαναφέρει τα συσσωματώματα ακτίνης και προστατεύει τις γέφυρες χρωματίνης από σπάσιμο, σε κύτταρα με μειωμένη PDZ. Δείξαμε επίσης ότι οι θυγατρικοί πυρήνες κυττάρων με άθικτες γέφυρες χρωματίνης βρίσκονται υπό μηχανική («πυρηνική») τάση, όπως φαίνεται από αλλαγές στο σχήμα του πυρήνα και στη μορφολογία της πυρηνικής μεμβράνης, κι ότι οι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες SUN1/2 και Nesprin 2 του συμπλόκου LINC συσσωρεύονται προς τη βάση των γεφυρών χρωματίνης. Μείωση των SUN1/2 ή της Nesprin 2, αλλά όχι της RhoA, ελαττώνει την παραμόρφωση του πυρήνα, εμποδίζει τη συσσώρευση των πρωτεϊνών του συμπλόκου LINC στη βάση των γεφυρών κι επάγει τη δημιουργία «χαλαρών» γεφυρών χρωματίνης χωρίς τάση. Επιπλέον, αναστολή του συμπλόκου LINC εμποδίζει τον σχηματισμό συσσωματωμάτων ακτίνης κι επάγει το σπάσιμο των γεφυρών χρωματίνης, υποδεικνύοντας μία έως τώρα άγνωστη σύνδεση μεταξύ της πυρηνικής τάσης, του συμπλόκου LINC και των συσσωματωμάτων ακτίνης. Χρησιμοποιώντας μεταλλαγμένες μορφές της Nesprin 2 σε πειράματα μείωσης της ενδογενούς πρωτεΐνης – αντικατάστασης, δείξαμε ότι η αλληλεπίδραση της Nesrpin 2 με τον κυτταροσκελετό ακτίνης και το πυρηνικό έλασμα είναι απαραίτητη για τη δημιουργία πυρηνικής τάσης και τη συσσώρευση πρωτεϊνών του συμπλόκου LINC στη βάση της γέφυρας χρωματίνης. Επιπλέον, δείξαμε ότι οι επαναλήψεις spectrin (SRs), οι οποίες βρίσκονται στο κυτταροπλασματικό τμήμα της Nesprin 2, είναι απαραίτητες για τη δημιουργία συσσωματωμάτων ακτίνης κι αλληλεπιδρούν με την PDZ RhoGEF σε κυτταρικά εκχυλίσματα και in vitro. Στόχευση της RhoA στη βάση των γεφυρών χρωματίνης, μέσω έκφρασης μεταλλαγμένων πρωτεϊνών Nesprin 2 υβριδικών με τις SRs ή με τη λειτουργική επικράτεια DHPH της PDZ RhoGEF που αλληλεπιδρά με τη RhoA, επαναφέρει τα συσσωματώματα ακτίνης κι εμποδίζει τη θραύση των γεφυρών χρωματίνης, σε κύτταρα με μειωμένη Nesprin. Επίσης, λανθασμένος εντοπισμός της Nesprin 2 σε πυρηνικά κοκκία μετά από υπερέκφραση της Lamin A εμποδίζει τον σχηματισμό συσσωματωμάτων ακτίνης και συσχετίζεται με τη δημιουργία κοκκίων ακτίνης που συνεντοπίζονται με τη Nesprin 2. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα προτείνουμε ότι, στην κυτταροκίνηση με γέφυρες χρωματίνης, το σύμπλοκο LINC είναι απαραίτητο για τη δημιουργία πυρηνικής τάσης. Η τάση αυτή προκαλεί συσσώρευση των πρωτεϊνών SUN1/2 και Nesprin 2 στη βάση των γεφυρών χρωματίνης και τοπικό εμπλουτισμό της PDZ RhoGEF μέσω πρόσδεσης της PDZ στις επαναλήψεις spectrin του κυτταροπλασματικού τμήματος της Nesprin 2. Έπειτα, η PDZ RhoGEF ενεργοποιεί την RhoA και τα σηματοδοτικά μονοπάτια ROCK – LIMK – Cofilin και mDia1 για να επάγει τον σχηματισμό συσσωματωμάτων ακτίνης και να εμποδίσει το σπάσιμο των γεφυρών χρωματίνης στην κυτταροκίνηση. Τα παραπάνω αποτελέσματα φανερώνουν ένα νέο μηχανοευαίσθητο μηχανισμό μέσω του οποίου τα κύτταρα με γέφυρες χρωματίνης μετατρέπουν το μηχανικό σήμα σε βιοχημική σηματοδότηση, μέσω του επαγόμενου από τάση LINC – PDZ – RhoA μοριακού μονοπατιού, για να επάγουν τον σχηματισμό συσσωματωμάτων ακτίνης και να διατηρήσουν την ακεραιότητα του γονιδιώματος.