Investigation of the natural history of aortic valve stenosis using methods of nuclear molecular imaging and microRNA analysis in a rabbit experimental model

Abstract

Degenerative aortic valve stenosis is the most common, clinically significant, human valvular disease and remains without pharmaceutical therapy. Our understanding of the pathophysiology of the disease focuses on osteoblastic differentiation, primarily of the interstitial cells of the aortic valve, which actively deposit large amounts of calcium phosphate salts in the tissue. In addition, the unregulated inflammatory response plays an important role among the many recognized mechanisms of the disease. However, molecular findings of osteoblastic transformation are also found in benign sclerosis of the valve, which most often does not progress to stenosis. The factors that lead to intense inflammation and progression to stenosis are unknown. The present thesis approaches the multiparametric study of molecular changes at the aortic valve level and their change over time, using as a tool an animal model of the disease in rabbits. Through a redesigned methodology of administering a hyperlipidemic diet and very high doses of vitamin D2, experimental aortic valve stenosis was achieved in rabbits. Extensive characterization and confirmation of the similarity of the lesion to the human disease was conducted, using molecular nuclear imaging of calcification, echocardiography, histology, spectroscopy and electron microscopy. The animal model was applied for tissue collection both during the final lesion and over time at earlier time phases. The protein, metabolic and transcriptional content of the valve was then analyzed in combination with infrared and Raman spectroscopic mapping, in order to investigate correlating changes over time belonging at both the cells and their extracellular matrix. The multiomic analysis in combination with the phenotypic studies revealed an early phase of the lesion, where the molecular fingerprint of osteoblastic conversion prevails without evidence of a pronounced inflammatory reaction, which suggests that inflammation may be an epiphenomenon of another process that is added to osteoblastic differentiation. Genes related to mechanotransduction, peroxidase activation, autophagy, DNA damage response, phospholipid-mediated pathways and neurodegenerative diseases, interacted with processes of extracellular matrix modification and inflammatory response. The earliest inflammatory activation involved the deposition of complement factors, immunoglobulins and the expression of the TLR6 receptor. The small non-coding RNAs miR-21, miR-204 and miR-146a controlled the phenotypic change in the experiment, and the first two were confirmed in a clinical study in end-stage patient samples, strengthening the reliability of the findings in rabbits. A set of genes was identified whose expression is significantly altered early, including the transcription factors Fos, Jun-B and AXIN2. The protein matrix surrounding the calcium deposits showed a significant change in its secondary structure, compatible with repetitive patterns such as fibrils or amyloid-like deposits of self-folded proteins. The appearance of calcium phosphate salts corresponding to non-crystalline organic hydroxyapatite was associated with a replacement of magnesium pyrophosphate by calcium pyrophosphate. The study distinguishes the molecular fingerprint preceding the inflammatory phase, which is associated with the phenotype of extensive calcification and stenosis of the aortic valve, in a very well-characterized animal model with relevance to humans.

Η στένωση αορτικής βαλβίδας εκφυλιστικής αιτιολογίας είναι η πιο συχνή κλινικά σημαντική ανθρώπινη βαλβιδοπάθεια και παραμένει χωρίς πρώιμη διάγνωση και φαρμακευτική θεραπεία. Η αντίληψή μας για την παθοφυσιολογία της νόσου, είναι ότι οφείλεται σε οστεοβλαστική μεταπλασία σε μοριακό επίπεδο, η οποία εκφράζεται κατά κύριο λόγο στα διάμεσα βαλβιδικά κύτταρα της αορτικής βαλβίδας, τα οποία ενεργητικά εναποθέτουν στον ιστό μεγάλες ποσότητες αλάτων φωσφορικού ασβεστίου. Επιπλέον, η μη ρυθμιζόμενη φλεγμονώδης αντίδραση κατέχει σημαντικό ρόλο ανάμεσα στην πλειάδα των αναγνωρισμένων μηχανισμών της νόσου. Εντούτοις, μοριακά ευρήματα οστεοβλαστικής μετατροπής ανευρίσκονται και στην καλοήθη σκλήρυνση της βαλβίδας, η οποία συνηθέστερα δεν εξελίσσεται σε στένωση. Δεν είναι γνωστοί οι παράγοντες που οδηγούν στην έντονη φλεγμονή και την εξέλιξη σε στένωση. Η παρούσα διατριβή πραγματεύεται την πολυπαραμετρική μελέτη των μοριακών μεταβολών σε επίπεδο αορτικής βαλβίδας και την μεταβολή αυτών στον χρόνο, χρησιμοποιώντας ως εργαλείο ένα ζωικό πρότυπο της νόσου σε κονίκλους. Μέσα από μια ανασχεδιασμένη μεθοδολογία χορήγησης υπερλιπιδαιμικής δίαιτας και πολύ υψηλών δόσεων βιταμίνης D2, επετεύχθη πειραματική στένωση αορτικής βαλβίδας σε κονίκλους και έγινε εκτεταμένος χαρακτηρισμός και επιβεβαίωση της ομοιότητας της βλάβης με την ανθρώπινη νόσο με χρήση μεθόδων μοριακής πυρηνικής απεικόνισης της επασβέστωσης, υπερηχοκαρδιογραφίας, ιστολογίας, φασματοσκοπίας και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας. Το ζωικό πρότυπο εφαρμόστηκε για την λήψη ιστού τόσο κατά την τελική βλάβη, όσο και διαχρονικά σε πρωιμότερες χρονικές φάσεις. Εν συνεχεία αναλύθηκε το πρωτεϊνικό, μεταβολικό και μεταγραφικό περιεχόμενο της βαλβίδας σε συνδυασμό με φασματοσκοπική χαρτογράφηση υπερύθρου και Raman, με σκοπό την αναζήτηση συσχετιζόμενων μεταβολών στον χρόνο και μεταξύ κυττάρων και εξωκυτταρίου στρώματος. Η πολυομική ανάλυση σε συνδυασμό με τις φαινοτυπικές μελέτες ανέδειξε μια πρώιμη φάση της βλάβης, όπου επικρατεί το μοριακό αποτύπωμα της οστεοβλαστικής μετατροπής χωρίς στοιχεία έντονης φλεγμονώδους αντίδρασης, κάτι που αναδεικνύει ότι η φλεγμονή μπορεί να είναι επιφαινόμενο μιας άλλης διεργασίας που επιπροστίθεται στην οστεοβλαστική μετατροπή. Γονίδια που σχετίζονται με την μηχανομετάδοση, την ενεργοποίηση του υπεροξειδιοσώματος, την αυτοφαγία, την απόκριση σε βλάβη του DNA, μονοπατιών μεσολαβούμενα από φωσφολιπίδια, γονίδια σχετιζόμενα με νευροεκφυλιστικές παθήσεις, αλληλεπίδρασαν με διεργασίες τροποποίησης του εξωκυτταρίου στρώματος και φλεγμονώδους αντίδρασης. Η πιο πρώιμη φλεγμονώδης ενεργοποίηση αφορούσε την εναπόθεση παραγόντων του συμπληρώματος, ανοσοσφαιρινών και την έκφραση του υποδοχέα TLR6. Τα μικρά μη κωδικά ριβονουκλεϊκά οξέα miR-21, miR-204 και miR-146a ελέγξαν την φαινοτυπική μεταβολή στο πείραμα και τα δύο πρώτα επιβεβαιώθηκαν σε κλινική μελέτη σε δείγματα ασθενών τελικού σταδίου, ενισχύοντας την αξιοπιστία των ευρημάτων στους κονίκλους. Εντοπίστηκε ένα σύνολο γονιδίων, των οποίων η έκφραση διαφοροποιείται πρώιμα σε σημαντικό βαθμό, περιλαμβανομένων των μεταγραφικών παραγόντων Fos, Jun-B και ΑΧΙΝ2. Το πρωτεϊνικό υπόστρωμα που περιβάλλει τις εναποθέσεις ασβεστίου παρουσίασε σημαντική μεταβολή στην δευτεροταγή δομή του, συμβατή με επαναλαμβανόμενα πρότυπα όπως ινίδια ή αμυλοειδικού τύπου εναποθέσεις αυτοπτυχώμενων πρωτεϊνών. Η εμφάνιση αλάτων φωσφορικού ασβεστίου που αντιστοιχούν σε μη κρυσταλλικό οργανικό υδροξυαπατίτη, συσχετίστηκε με σταδιακή αντικατάσταση πυροφωσφορικού μαγνησίου από πυροφωσφορικό ασβέστιο. Η μελέτη διακρίνει το μοριακό αποτύπωμα της βαλβίδας που προηγείται της φλεγμονώδους φάσης και συσχετίζεται διαχρονικά με την εμφάνιση του φαινοτύπου της εκτεταμένης επασβέστωσης και στένωσης της αορτικής βαλβίδας, σε ένα πολύ καλά χαρακτηρισμένο ζωικό πρότυπο με αντιστοιχία στον άνθρωπο.