Ανάπτυξη λιποσωμικών μορφών αυξητικών ή/και οστεογενετικών παραγόντων και εκτίμηση της οστεο-αναγεννητικής ικανότητας τους σε in vitro μοντέλα πριν και έπειτα από την ενσωμάτωσή τους σε μεμβράνες ηλεκτροϊνοποίησης (electrospinning)

Abstract

Nowadays, there are several diseases of bone deficits that remain an important challenge in orthopedic surgery, since the management and regeneration of bone deficits is a global health issue. Critically large defects of long bones represent one of the main causes of fracture nonunion. Autografts offer ideal compatibility, but are often not suitable for large deficits and are often affected by the immune response. Thus, the limited effectiveness of strategies with compatibility for large bone deficits and the advanced age of the patients, lead the research community to explore novel potential therapeutic approaches. Bone regeneration is a complex process, which requires the highly coordinated presence of biochemical molecules/signals to promote the various stages of angiogenesis and osteogenesis. The most important biochemical molecules that play a role in the above processes are growth factors, such as bone morphogenetic factor 2 (BMP-2), angiogenic growth factor (PDGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The spatio-temporal expression of these factors is importance for bone regeneration. In order to spatiotemporally regulate the expression of growth factors, the use of scaffolds and/or biologically compatible nanocarriers is required. Scaffolds can be composed by various biocompatible polymers (PCL, PVA, PLGA) and through the three-dimensional structure they form, they offer the mechanical support for tissue growth as well as the appropriate environment for cell proliferation and differentiation. On the other hand, important nanocarriers for bone regeneration are liposomes, which are biocompatible, non-toxic, and can offer increased drug entrapment compared to other nanocarriers, controlled release rate, potential to target specific cells and tissues, protect the activity of the drug and overcome biological barriers. The purpose of this study was the development of liposomal formulations of growth factors (BMP-2, PDGF) and bioactive lipids (FTY720, S1P), through microfluidic flow focusing technique, and moreover their integration into electrospun fibers; finally, their biological activity was evaluated, in vitro. The bioactive molecules which are used are involved in the process of bone regeneration, triggering processes such as osteogenesis, angiogenesis, cell proliferation and chemotaxis. Liposomal agents were initially studied for their proliferative and osteogenic capacity, in two cell lines, fibroblasts (L929 cells) and pre-osteoblasts (3T3 cells). In addition, chemotaxis and angiogenesis were studied following the effect of liposomal FTY720. The liposomal agents were then incorporated into coaxial electrospinning membranes according to the optimal conditions resulting from technique optimization experiments using the liposomal calcein as a model. Proliferation and osteogenic activity experiments of fibroblasts were then carried out, for the effect of electrospinning on the incorporated liposomal factors and the incorporated free forms respectively. Finally, the stability of free, liposomal and membrane-embedded liposomal agents over time (and up to 6 months) at 37˚C was studied too. According to the results, the prepared liposomes were haemocompatible, non-toxic/genotoxic and had a size of 68-112nm and a polydispersity index of 0.150-0.231. Furthermore, they were found to be active in in vitro studies, demonstrating increased cell viability/proliferation and osteogenesis. Furthermore, the liposomal agent FTY720 induced an increase in cell chemotaxis and showed an angiogenic effect in the ex vivo chick chorioallantoic membrane model. Following the incorporation experiments of the free and liposomal agents in the electrospun membranes, the results of proliferation and osteogenic ability of the agents in fibroblasts, showed that the liposomes protect the activity of the entrapped molecules during the electrospinning process, while the free agents are affected and their activity is reduces. The stability study highlighted the capability of the liposomal agents (embedded or not in membranes) to maintain their biological activity over time even after 6 months, at body temperature. The present study is part of the European program Smart Bone Regeneration (H2020) which aims to create a three-dimensional 'smart' implant that provides mechanical tissue support, while additionally integrating stem cells and bioactive factors with the aim of effectively treating long bone defects.

Σήμερα, αρκετές είναι οι παθήσεις οστικών ελλειμμάτων που παραμένουν μια σημαντική πρόκληση στην ορθοπεδική χειρουργική, αφού η αντιμετώπισή τους και η ανάπλαση των οστικών ελλειμμάτων είναι ένα σημαντικό πρόβλημα στην παγκόσμια υγεία. Τα κρίσιμα μεγάλου μεγέθους ελλείμματα των μακρών οστών αντιπροσωπεύουν μία από τις κύριες αιτίες της μη συνένωσης καταγμάτων (Non-unions). Τα αυτομοσχεύματα προσφέρουν ιδανική συμβατότητα, ωστόσο συχνά δεν είναι κατάλληλα για μεγάλα ελλείμματα και αρκετές φορές επηρεάζονται από την ανοσοαπόκριση. Έτσι, η περιορισμένη αποτελεσματικότητα των στρατηγικών με συμβατότητα για μεγάλα ελλείμματα οστών και η μεγάλη ηλικία των ασθενών, οδηγούν την ερευνητική κοινότητα σε μελέτες για την εύρεση μίας αποτελεσματικής θεραπευτικής προσέγγισης. Η οστική αναγέννηση είναι μια πολύπλοκη διαδικασία, η οποία απαιτεί την εξαιρετικά συντονισμένη (τοπικά και χρονικά) παρουσία βιοχημικών μορίων/σημάτων για την προώθηση των διαφόρων σταδίων αγγειογένεσης και οστεογένεσης. Τα πιο σημαντικά βιοχημικά μόρια που παίζουν ρόλο στις παραπάνω διαδικασίες είναι οι αυξητικοί παράγοντες, όπως ο μορφογενετικός παράγοντας οστών 2 (BMP-2), ο αγγειογενετικός αυξητικός παράγοντας (PDGF) και ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGF). Μεγάλη σημασία έχει ο χωροχρόνος έκφρασης των παραγόντων αυτών για την αναγέννηση του οστού. Για να μπορεί να ρυθμιστεί χωροχρονικά η έκφραση των αυξητικών παραγόντων απαιτείται η χρήση ικριωμάτων ή/και βιολογικά συμβατών νανοφορέων. Τα ικριώματα μπορούν να αποτελούνται από διάφορα βιοσυμβατά πολυμερή (PCL, PVA, PLGA) και μέσω της τρισδιάστατης δομής που σχηματίζουν, να προσφέρουν την μηχανική υποστήριξη για την ανάπτυξη ιστών καθώς και το κατάλληλο περιβάλλον για τον πολλαπλασιασμό και την διαφοροποίηση των κυττάρων. Από την άλλη, σημαντικοί νανοφορείς για την αναγέννηση οστών αποτελούν τα λιποσώματα, τα οποία παρουσιάζουν βιοσυμβατότητα, είναι μη-τοξικά, και μπορούν να προσφέρουν αυξημένο εγκλωβισμό φαρμάκων σε σύγκριση με άλλους νανοφορείς, ελεγχόμενο ρυθμό απελευθέρωσης, ικανότητα στόχευσης συγκεκριμένων κυττάρων και ιστών, προστασία ενεργών συστατικών και ικανότητα υπέρβασης βιολογικών φραγμών. Σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η ανάπτυξη λιποσωμικών μορφών, αυξητικών παραγόντων (ΒMP2, PDGF) και βιοδραστικών λιπιδίων (FTY720, S1P), μέσω της τεχνικής ανάμιξης μικροροών (microfluidic flow focusing), η ενσωμάτωση τους σε ηλεκτροϊνοποιημένες ίνες και η μελέτη της βιολογικής δραστικότητας τους in vitro. Τα βιοδραστικά μόρια που μελετήθηκαν εμπλέκονται στην διαδικασία της αναγέννησης οστών, πυροδοτώντας διαδικασίες οστεογένεσης, αγγειογένεσης, πολλαπλασιασμού και χημειοτακτισμού των οστεοβλαστών. Οι λιποσωμικοί παράγοντες αρχικά μελετήθηκαν για την ικανότητα πολλαπλασιασμού και οστεογένεσης, σε δυο κυττατικές σειρές, τους ινοβλάστες (L929 κύτταρα) και τους προ-οστεοβλάστες (3T3 κύτταρα). Επιπλέον, μελετήθηκε ο χημειοτακτισμός των κυττάρων και η αγγειογένεση, έπειτα από την επίδραση του λιποσωμικού FTY720. Στη συνέχεια οι λιποσωμικοί παράγοντες ενσωματώθηκαν σε μεμβράνες ηλεκτροϊνοποίησης (coaxial electrospinning) σύμφωνα με τις βέλτιστες συνθήκες που προέκυψαν από τα πειράματα βελτιστοποίησης της τεχνικής χρησιμοποιώντας το πρότυπο μοντέλο λιποσωμικής καλσεΐνης. Έπειτα πραγματοποιήθηκαν πειράματα πολλαπλασιασμού και οστεογενετικής δραστικότητας των ινοβλαστών, για την επίδραση της ηλεκτροϊνοποίησης στους ενσωματωμένους λιποσωμικούς παράγοντες και τις ενσωματωμένες ελεύθερες μορφές αντίστοιχα. Τέλος, μελετήθηκε η σταθερότητα των ελεύθερων, λιποσωμικών και λιποσωμικών παραγόντων ενσωματωμένων σε μεμβράνες κατά την πάροδο του χρόνου (και μέχρι τους 6 μήνες) στους 37˚C. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα τα λιποσώματα που παρασκευάστηκαν ήταν αιμοσυμβατά, μη τοξικά/γενοτοξικά και είχαν μέγεθος 68-112nm και δείκτη πολυδιασποράς 0.150-0.231. Επιπλέον, είχαν αποτελεσματική δραστικότητα στις in vitro μελέτες, προκαλώντας αυξημένη βιωσιμότητα/πολλαπλασιασμό και οστεογενετικής ικανότητας των κυττάρων. Ακόμη, ο λιποσωμικός παράγοντας FTY720, προκάλεσε αύξηση του χημειοτακτισμού των κυττάρων και παρουσιάστηκε η αγγειογενετική του δράση στο ex vivo μοντέλο χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης νεοσσών. Στην συνέχεια από τα πειράματα ενσωμάτωσης των ελεύθερων και λιποσωμικών παραγόντων στις μεμβράνες ηλεκτροϊνοποίησης, τα αποτελέσματα πολλαπλασιασμού και οστεογενετικής ικανότητας των παραγόντων στους ινοβλάστες, έδειξαν ότι τα λιποσώματα προστατεύουν την δραστικότητα των εγκλωβισμένων μορίων κατά την τεχνική ηλεκτροϊνοποίησης, ενώ οι ελεύθεροι παράγοντες επηρεάζονται σε μεγαλύτερο βαθμό και μειώνεται η δραστικότητα τους. Η μελέτη σταθερότητας ανέδειξε την ανάγκη για χρήση λιποσωμικής μορφής των παραγόντων (ενσωματωμένων ή μη σε μεμβράνες), ώστε να διατηρείται η βιολογική τους δράση στην πάροδο του χρόνου ακόμη και μετά από 6 μήνες, σε θερμοκρασία σώματος. Η παρούσα μελέτη αποτελεί μέρος του Ευρωπαϊκού προγράμματος Smart Bone Regeneration (H2020) το οποίο έχει ως στόχο την δημιουργία ενός τρισδιάστατου ‘έξυπνου’ εμφυτεύματος (smart implant) που απορροφάται και παρέχει μηχανική υποστήριξη των ιστών, ενώ μπορεί παράλληλα να ενσωματώνει βλαστοκύτταρα και βιοδραστικούς παράγοντες που εκλoύονται με ρυθμιζόμενη κινητική, με σκοπό την αναγέννηση μακρών οστών.