Study of the influence of pH on the toxicity of xenobiotics in aquatic organisms through toxicokinetics and metabolomics approaches utilizing high resolution mass spectrometric techniques

Abstract

In recent decades, concerns regarding the potential threats to aquatic organisms have been raised by the increasing detection of organic compounds and their metabolites in aquatic ecosystems. Most of these compounds belong to the group of ionizable organic compounds (IOCs). Their chemical speciation, neutral or ionic, varies depending on the pH of the surrounding environment. Neutral species permeate membranes more easily and may thus have a higher toxicity. Therefore, the toxicokinetics of organic compounds in aquatic organisms, including adsorption, distribution, metabolism, and excretion (ADME), should be investigated for a comprehensive risk assessment. Many research studies overlook the extended investigation of the biotransformation process, although it provides valuable insights to understand the whole impact of the parent compounds and their metabolites in aquatic organisms. The main objective of this study is to assess the effect of physicochemical properties, specifically pH, on toxicity, uptake, bioaccumulation, and biotransformation of organic compounds in aquatic organisms. An integrated methodology, including toxicokinetic and metabolomic approaches, was established for assessing the effects of different xenobiotics on aquatic organisms. Generic protocols for sample preparation, analysis of the samples, and data treatment were developed to ensure the maximum reliability of our results. Additionally, a comprehensive workflow for the identification of the potential metabolites in the aquatic organisms was established (Chapter 3).Furthermore, the effects of different pH values on the toxicity, uptake, and bioaccumulation of organic compounds were investigated utilizing three model organisms, zebrafish embryos (ZFE), daphnia magna, and lemna minor. For the analysis of the samples, high-resolution mass spectrometric techniques, especially RPLC/HILIC-LC-HRMS and LC-TIMS-HRMS, were used.LC50 values, internal concentrations (Cint), and bioconcentration factors (BCFs) were determined (Chapter 4).Additionally, the biotransformation capacity of zebrafish embryos exposed to pharmaceuticals was evaluated. Several biotransformation products from phase I and phase II metabolic reactions were detected, and potential metabolic pathways of Ibuprofen (IBU) and Metoprolol (MET) in ZFE were proposed. Moreover, the influence of biotransformation processes on internal concentrations of IOCs was also examined. Biotransformation products may have a different toxicity profile and higher bioaccumulation potential than their parent compounds, so the results of this study illustrate the role of biotransformation in toxicokinetic studies (Chapter 5). The overall results of this thesis underscore that the different pH values of the surrounding medium may influence toxicokinetics therefore a key factor to be considered in the respective studies. Internal concentration emerged as a more representative metric for assessing toxicity and is recommended to be used alongside LC50 values for comprehensive risk assessment. Concerning biotransformation, ZFE seems to extensively metabolize pharmaceuticals, such as IBU and MET. Biotransformation greatly contributes to the internal concentration of the parent compounds and may affect their toxicity. Therefore, the whole xeno-metabolome (both xenobiotics and their metabolites) should be investigated complementary to the internal concentration in toxicokinetic studies, for a holistic interpretation of toxicity.

Τις τελευταίες δεκαετίες έχει παρατηρηθεί μια αυξανόμενη ανίχνευση διάφορων οργανικών ενώσεων καθώς και μεταβολιτών τους στα υδάτινα οικοσυστήματα. Αυτό έχει προκαλέσει μια ανησυχία στην επιστημονική κοινότητά σχετικά με τις πιθανές απειλές στους υδάτινους οργανισμούς και τελικά στην υγεία του ανθρώπου. Οι περισσότερες από αυτές τις ενώσεις ανήκουν στην ομάδα των ιοντιζόμενων οργανικών ενώσεων (IOCs). Η χημική τους μορφή που μπορεί να είναι ουδέτερη ή ιοντισμένη, επηρεάζεται από τις τιμές pH του περιβάλλοντος. Ενώσεις που βρίσκονται σε ουδέτερη μορφή φαίνεται να διαπερνούν πιο εύκολα τις μεμβράνες των οργανισμών και αναμένεται να έχουν μεγαλύτερη τοξικότητα. Επομένως, η τοξικοκινητική των οργανικών ενώσεων στους υδρόβιους οργανισμούς, συμπεριλαμβανομένης της πρόσληψης, της κατανομής, του μεταβολισμού και της απέκκρισης (ADME), θα πρέπει να διερευνάται για μια πιο ολοκληρωμένη εκτίμηση κινδύνου. Πολλές ερευνητικές μελέτες δεν περιλαμβάνουν εκτενής διερεύνηση της βιομετατροπής, παρόλο που μπορεί να παράσχει πολύτιμες πληροφορίες για την κατανόηση της συνολικής επίδρασης τόσο των μητρικών ενώσεων όσο και των μεταβολιτών τους στους υδρόβιους οργανισμούς. Ο κύριος στόχος αυτής της διατριβής είναι να μελετηθεί η επίδραση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων, και πιο συγκεκριμένα το pH, στην τοξικότητα, την πρόσληψη, τη βιοσυσσώρευση και τη βιομετατροπή ξενοβιοτικών ενώσεων σε υδρόβιους οργανισμούς. Μια ολοκληρωμένη μεθοδολογία, που περιλαμβάνει τοξικοκινητική και μεταβολομική προσέγγιση, δημιουργήθηκε για την αξιολόγηση των επιδράσεων διαφόρων ξενοβιοτικών ενώσεων στους υδρόβιους οργανισμούς. Αναπτύχθηκαν γενικά πρωτόκολλα για την προετοιμασία και την ανάλυση των δειγμάτων, αλλά και για την επεξεργασία των δεδομένων, ώστε να εξασφαλίζεται η μέγιστη αξιοπιστία των παραγόμενων αποτελεσμάτων. Επιπλέον, αναπτύχθηκε μια ολοκληρωμένη ροή εργασίας για την ταυτοποίηση των πιθανών μεταβολιτών σε υδρόβιους οργανισμούς (Κεφάλαιο 3). Επιπλέον, διερευνήθηκε η επίδραση διαφορετικών τιμών pH στην τοξικότητα, την πρόσληψη και τη βιοσυσσώρευση οργανικών ενώσεων χρησιμοποιώντας τρεις πρότυπους οργανισμούς, συγκεκριμένα έμβρυα zebrafish (ZFE), daphnia magna και lemna minor. Για την ανάλυση των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκαν τεχνικές φασματομετρίας μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητάς, συγκεκριμένα RPLC/HILIC-LC-HRMS και LC-TIMS-HRMS. Οι τιμές LC50, οι εσωτερικές συγκεντρώσεις (Cint) και οι παράγοντες βιοσυσσώρευσης (BCF) προσδιορίστηκαν (Κεφάλαιο 4). Επιπρόσθετα, αξιολογήθηκε η ικανότητα των εμβρύων zebrafish να βιομετατρέπουν φαρμακευτικές ενώσεις. Ανιχνεύθηκαν διάφορα προϊόντα βιομετασχηματισμού από αντιδράσεις της φάσης Ι και φάσης ΙΙ του μεταβολισμού, και προτάθηκαν πιθανά μεταβολικά μονοπάτια για τις ενώσεις Ibuprofen και Metoprolol στα έμβρυα zebrafish. Παράλληλα, εξετάστηκε η επίδραση της βιομετατροπής τις εσωτερικές συγκεντρώσεις των ιοντιζόμενων οργανικών ενώσεων. Τα προϊόντα βιομετατροπής ενδέχεται να έχουν διαφορετικό προφίλ τοξικότητας και υψηλότερο δυναμικό βιοσυσσώρευσης από τις μητρικές ενώσεις τους, επομένως τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης αναδεικνύουν το ρόλο της βιομετατροπής στις μελέτες τοξικοκινητικής (Κεφάλαιο 5). Τα συνολικά αποτελέσματα της παρούσας διατριβής υπογραμμίζουν ότι οι διαφορετικές τιμές pH του περιβάλλοντος μπορεί να επηρεάσουν την τοξικοκινητική και επομένως αποτελούν βασικό παράγοντα που θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη στις αντίστοιχες μελέτες. Η εσωτερική συγκέντρωση αναδείχθηκε ως πιο αντιπροσωπευτικό μέτρο εκτίμησης της τοξικότητας και συνιστάται να χρησιμοποιείται παράλληλα με τις τιμές LC50 για πιο ολοκληρωμένη εκτίμηση του κινδύνου. Όσον αφορά την βιομετατροπή, τα έμβρυα zebrafish φαίνεται να μεταβολίζουν εκτενώς φαρμακευτικές ενώσεις, όπως το Ibuprofen και το Metoprolol. Η βιομετατροπή φαίνεται να συμβάλει σημαντικά στην εσωτερική συγκέντρωση της μητρικής ένωσης και ενδεχομένως μπορεί να επηρεάσει την τοξικότητά τους. Ως εκ τούτου, οι ξενοβιοτικές ενώσεις και οι μεταβολίτες τους θα πρέπει να διερευνώνται συμπληρωματικά προς την εσωτερική συγκέντρωση στις διάφορες μελέτες τοξικοκινητικής, για μια ολιστική ερμηνεία της τοξικότητας.