Φυτοχημική μελέτη και αξιολόγηση της αντιϊικής, αντιφλεγμονώδους και ηπατοπροστατευτικής δράσης φυτών της ελληνικής χλωρίδας

Abstract

The aim of this thesis is the study of selected plant species of the Greek flora for their phytochemical content and for the isolation and identification of secondary metabolites, using modern, environmentally friendly "green" extraction and chromatographic techniques and the study of their spectroscopic data. In addition, the biological activity of selected extracts against H1N1 influenza viruses, anti-inflammatory, hepatoprotective and antioxidant activities were studied. Chapter 1 of the thesis includes the preparation of extracts of Primula veris, using ultrasound-assisted and supercritical CO2 (SFE) extraction techniques. TLC, HPLC-ELSD and GC-MS methods were used to study the phytochemical profiles. The phytochemical study of the dichloromethane extract of P. veris. plant was carried out by TLC ,HPTLC, HPLC-UV-DAD, HPLC-UV-ELSD and GC-MS FCPC techniques, sequential open column chromatography under pressure, preparative TLC and shephadex chromatography in order to separate each extract into individual fractions of similar polarity and isolate the pure components. The structures were identified by studying their spectroscopic data (NMR and LC-MS spectra). 58 compounds were detected and identified by UHPLC-Orbitrap-HRMS method while 17 compounds were isolated from the classes of flavones, phenolic derivatives, terpenes, etc. The phytochemical study of the aqueous extract of P. veris plant led to the identification of 44 compounds and isolation and identification of 8 compounds. Finally, the evaluation of all the extracts of P. veris of their antiviral activity was carried out on MDCK cells susceptible to H1N1 viruses. In chapter 2 of the thesis, the extraction of 5 species of Cistus (C. creticus subsp. creticus, C. creticus subsp. eriocephalus, C. parviflorus, C. monspeliensis and C. salvifolius) was carried out using the ultrasound-assisted extraction (UAE) method. The HPLC-UV-DAD technique was applied to study the phytochemical profiles and a comparative study of the water-alcohol extracts was performed. 82 metabolites were detected and identified by UHPLC-Orbitrap-HRMS technique, in positive and negative ionization. Further phytochemical study of the EtOAc extract of C .monspeliensis. led to the isolation and identification of 9 metabolites belonging to the diterpene class. In parallel with the phytochemical study, the possible protective effect of the water-alcoholic and aqueous extracts of the 5 Cistus species on the fatty liver was carried out. The water-alcoholic extract of C. creticus subsp. eriocephalus showed remarkable activity. The CPE method was applied to separate the extract into individual fractions and isolate pure components. In the third chapter of the thesis, the essential oils of four endemic plants of the genus Stachys of the family Lamiaceae (S. spetzenhoferi subsp speitzenhoferi, S. spetzenhoferi subsp virella, S. canescens and S. euboica) were prepared and studied using the method of hydrodistillation and analysis by GC-MS, while NMR spectroscopy was used for the identification of some components. This was followed by the evaluation of the anti-inflammatory activity of the essential oils, in mouse skin fibroblasts where inflammation was activated using TNF-a. This was followed by the preparation of extracts (with DCM, MeOH and H2O solvents) of the above 4 species of the genus Stachys and for S. virgata additionally with DCM, EtOH and EtOH/H2O solvents. The extracts were evaluated for a) their antioxidant activity, b) flavonoid content and c) phenolic derivatives, using the free radical techniques DPPH, TFC and TPC respectively. The inhibitory activity of the extracts on enzymes associated with the skin ageing process (tyrosinase and elastase) was also evaluated. Finally, the phytochemical study of Stachys virgata water-alcohol extract was carried out. The structures of the isolated compounds were identified by studying their spectroscopic data (NMR and LC-MS spectra) and 4 metabolites (2 flavonoids, 1 iridoid and 1 phenolic derivative) were identified.

Αντικείμενο της παρούσας διατριβής αποτελεί η μελέτη επιλεγμένων φυτικών ειδών της ελληνικής χλωρίδας ως προς το φυτοχημικό τους περιεχόμενο και για την απομόνωση και ταυτοποίηση δευτερογενών μεταβολιτών, με την χρήση σύγχρονων, φιλικών προς το περιβάλλον «πράσινων» εκχυλιστικών και χρωματογραφικών τεχνικών και μελέτη των φασματοσκοπικών τους δεδομένων. Επιπλέον μελετήθηκε η βιολογική δράση επιλεγμένων εκχυλισμάτων έναντι ιών της γρίπης Η1Ν1, η αντιφλεγμονώδης, η ηπατοπροστατευτική και η αντιοξειδωτική δράση. Το 1ο κεφάλαιο της διατριβής περιλαμβάνει την παρασκευή εκχυλισμάτων του φυτού Primula veris, με τεχνική εκχύλισης υποβοηθούμενη με υπερήχους καθώς και με υπερκρίσιμο CO2 (SFE). Για την μελέτη των φυτοχημικών προφίλ χρησιμοποιήθηκαν οι μέθοδοι TLC, HPLC-ELSD και GC-MS. Η φυτοχημική μελέτη του διχλωρομεθανικού εκχυλίσματος του φυτού P.veris. πραγματοποιήθηκε με τεχνικές TLC ,HPTLC, HPLC-UV-DAD, HPLC-UV-ELSD και GC-MS FCPC, διαδοχικές χρωματογραφίες ανοιχτής στήλης υπό πίεση, παρασκευαστική TLC και χρωματογραφία Shephadex, προκειμένου να διαχωριστεί το κάθε εκχύλισμα σε επιμέρους κλάσματα παρόμοιας πολικότητας και να απομονωθούν τα καθαρά συστατικά. Οι δομές ταυτοποιήθηκαν με μελέτη των φασματοσκοπικών τους δεδομένων (φάσματα NMR και LC-MS). Ανιχνεύθηκαν και ταυτοποιήθηκαν 58 ενώσεις με τη μέθοδο UΗPLC-Orbitrap-HRMS ενώ απομονώθηκαν 17 ενώσεις, από τις κατηγορίες των φλαβονών, φαινολικών παραγώγων, τερπενίων κ.α.. Η φυτοχημική μελέτη του υδατικού εκχυλίσματος του φυτού P. veris οδήγησε στην ταυτοποίηση 44 ενώσεων και στην απομόνωση και ταυτοποίηση 8 ενώσεων. Τέλος, πραγματοποιήθηκε η αξιολόγηση όλων των εκχυλισμάτων του P.veris όσον αφορά την αντιική τους δράση, σε κύτταρα MDCK , τα οποία είναι επιδεκτικά στους ιούς Η1Ν1. Στο 2ο κεφάλαιο της διατριβής πραγματοποιήθηκε η εκχύλιση 5 ειδών του γένους Cistus (C. creticus subsp. creticus, C. creticus subsp. eriocephalus, C. parviflorus, C. monspeliensis και C. salvifolius) με τη μέθοδο εκχύλισης υποβοηθούμενη με υπερήχους (UAE). Για την μελέτη των φυτοχημικών προφίλ εφαρμόστηκε η τεχνική HPLC-UV-DAD και έγινε συγκριτική μελέτη των υδατοαλκοολικών εκχυλισμάτων. Ανιχνεύθηκαν και ταυτοποιήθηκαν 82 μεταβολιτες με την τεχνική UΗPLC-Orbitrap-HRMS, σε θετικό και σε αρνητικό ιονισμό. Η περαιτέρω φυτοχημική μελέτη του εκχυλίσματος EtOAc του C .monspeliensis οδήγησε στην απομόνωση και ταυτοποίηση 9 μεταβολιτών που ανήκουν στην κατηγορία των διτερπενίων. Παράλληλα με την φυτοχημική μελέτη πραγματοποιήθηκε η πιθανή προστατευτική δράση των υδατοαλκοολικών και υδατικών εκχυλισμάτων των 5 ειδών Cistus στο λιπώδες ήπαρ. Αξιοσημείωτη δράση έδειξε το υδατοαλκοολικό εκχύλισμα του C. creticus subsp. eriocephalus. Για τον διαχωρισμό του εκχυλίσματος σε επιμέρους κλάσματα και την απομόνωση καθαρών συστατικών εφαρμόστηκε η μέθοδος CPΕ.Στο 3ο κεφάλαιο της διατριβής παρασκευάστηκαν και μελετήθηκαν τα αιθέρια έλαια των 4 ενδημικών φυτών του γένους Stachys της οικογένειας Lamiaceae (S. spretzenhoferi subsp spreitzenhoferi, S. spretzenhoferi subsp virella, S .canescens και S. euboica), με τη μέθοδο της υδραπόσταξης και ανάλυσης με τη μέθοδο GC-MS, ενώ για την ταυτοποίηση ορισμένων συστατικών χρησιμοποιήθηκε φασματοσκοπία NMR. Ακολούθησε η αξιολόγηση της αντιφλεγμονώδους δράσης των αιθέριων ελαίων, σε ινοβλάστες δέρματος ποντικού όπου η φλεγμονή ενεργοποιήθηκε με τη χρήση TNF-a. Στη συνέχεια ακολούθησε η παρασκευή εκχυλισμάτων (με διαλύτες DCM, MeOH και H2O) των ανωτέρω 4 ειδών του γένους Stachys και για το S. virgata επιπλέον με διαλύτες DCM, ΕtΟΗ και ΕtΟΗ/Η2Ο. Τα εκχυλίσματα αξιολογήθηκαν για α) την αντιοξειδωτική τους ικανότητα, β) την περιεκτικότητα σε φλαβονοειδή και γ) σε φαινολικά παράγωγα, με τις τεχνικές της ελεύθερης ρίζας DPPH, TFC και TPC αντίστοιχα. Επίσης, αξιολογήθηκε η ανασταλτική δράση των εκχυλισμάτων σε ένζυμα τα οποία συνδέονται με την διαδικασία γήρανσης του δέρματος (τυροσινάση και ελαστάση). Τέλος πραγματοποιήθηκε η φυτοχημική μελέτη των υδατοαλκοολικού εκχυλίσματος του Stachys virgatα. Οι δομές των απομονωμένων ενώσεων ταυτοποιήθηκαν με τη μελέτη των φασματοσκοπικών τους δεδομένων (φάσματα NMR και LC-MS) και ταυτοποιήθηκαν 4 μεταβολίτες (2 φλαβονοειδή, 1 ιριδοειδές και 1 φαινολικό παράγωγο).